La cryoconservation de tissu cortical Blocs pour la génération des cultures de neurones hautement enrichi

Bonjour, je m’appelle Alan et je suis le laboratoire du Dr Horney Lu à l’Université de Californie à Irvine dans le département de neurobiologie et de comportement. Et je m’appelle Bob. Aujourd’hui, le Dr Haro vous montrera un protocole rapide, efficace et fiable pour la cryoconservation de routine des blocs de tissu cortical pour la dégénérescence ultérieure de cultures neuronales primaires de haute qualité.

Alors commençons. Les tissus nettoyés et hachés sont chargés dans des flacons cryogéniques contenant un TMSO à 10 %. Médium de congélation.

Les flacons cryogéniques sont chargés dans un récipient de congélation et placés à moins 80 degrés Celsius pendant au moins quatre heures. Les flacons cryogéniques congelés sont ensuite placés dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme. Pour la culture d’AC, le flacon cryogénique est fondu dans un bain d’eau chaude et rincé avec du HBSS chaud pour éliminer le DMSO restant.

Fresh HBSS est ajouté avec des essais de dissociation, après quoi DMM avec 10 % d’EBS est ajouté. Pour arrêter l’activité enzymatique dissociative, les cellules sont filées et la pastille est remise en suspension dans du DMM frais plus 10 % d’EBS et plaquée sur des boîtes en polylysine pré-enrobées. Après 24 heures, le DMM est passé à un milieu neurobasal supplémenté et a été cultivé pendant 10 jours.

Ce protocole utilise une lame de rasoir en acier pour hacher le tissu cortical avant utilisation. Le rasoir doit être stérilisé à l’éthanol à 70 % pendant au moins deux heures. Une solution saline tamponnée HBSS est créée en diluant une solution mère de 10 x dans de l’eau stérilisée, puis la solution X-H-B-S-S est ensuite conservée sur de la glace ou à quatre degrés Celsius jusqu’au traitement des tissus.

L’oxyde de diméthylsulf ou DMSO est utilisé comme cryoprotection dans les milieux de congélation. Ce protocole utilise un volume de 10 % et une dilution volumique de DMSO dans un X-H-B-S-S-D-M-S-O doit être complètement mélangé avant de le stocker à quatre degrés Celsius. Nalgene et le conteneur de congélation sont utilisés pour contrôler le taux de congélation des échantillons.

Le récipient de congélation est chargé de flacons cryogéniques de 2,5 millilitres qui ont été étiquetés au préalable. C’est aussi une bonne idée d’étiqueter les récipients de congélation eux-mêmes si vous en avez plus d’un et de noter le récipient correspondant sur la bile. Le 10 % de DMSO, le fluide de congélation préalablement refroidi, ainsi que le récipient de congélation sont amenés dans une enceinte de sécurité biologique stérile.

Ici, un millilitre de fluide de congélation est lentement ajouté à chacun des flacons cryogéniques Après vous être assuré que les bouchons sont bien fixés, placez le récipient de congélation avec les flacons à quatre degrés Celsius pendant au moins deux heures juste avant le traitement des tissus. La lame de rasoir préalablement stérilisée doit être rincée abondamment. Trois, trois lavages minutes.

L’utilisation d’eau stérilisée devrait suffire pour éliminer tout éthanol restant. Cette procédure de lavage doit être rapide car le rasoir est sujet à l’oxydation en cas d’immersion prolongée et d’eau stérile. Avant le nettoyage, le mouchoir doit être placé sur un sac de glace.

Rincez légèrement à froid X-H-B-S-S pour éliminer tous les débris flottants. Des aiguilles stérilisées sont utilisées pour nettoyer les morceaux de tissu de toutes les membranes et vaisseaux sanguins restants. Des précautions doivent être prises pour préserver l’intégrité structurelle du tissu pendant le nettoyage.

Au fur et à mesure que cela augmentera, l’efficacité de la coupe des tissus propres sera visiblement différente de celle des tissus bruts et la plupart des membranes ou des vaisseaux sanguins devraient être retirés. Une fois qu’un mouchoir a été nettoyé et rincé, le hachage peut commencer. Il est important de faire des coupes nettes du tissu, créant des blocs d’environ un millimètre cube.

Les blocs trop gros nivellent un rendement cellulaire plus faible à la décongélation. Cependant, les blocs plus petits, le surtraitement doit également être évité. Les tissus hachés peuvent être prélevés à l’aide d’une pipette automatique et d’une pipette X-H-B-S-S.

Assurez-vous de rincer le plat avec du HBSS pour récupérer tous les tissus recueillis. Le tissu est ensuite ajouté à un grand volume d’un X-H-B-S-S et laissé tomber au fond, créant une pastille légèrement tassée. Cela permet de nettoyer tous les débris restants qui peuvent être présents pendant que les tissus se déposent dans le HBSS, de récupérer le récipient de congélation précédemment réfrigéré et les flacons cryogéniques avant d’attribuer les tissus.

Assurez-vous de déboucher tous les flacons pour accélérer le processus de remplissage des tissus. L’exposition au DMSO à température ambiante ne doit pas dépasser 10 minutes. C’est une bonne idée de travailler avec un récipient de congélation à la fois jusqu’à ce que tous les mouchoirs soient utilisés.

Commencez à aspirer le supernat d’un tissu lâche, granulez le maïs aussi près que possible de la pastille sans la déranger. Montez ensuite une pointe à orifice de 200 microlitres de large sur une pipette. N’utilisez pas un orifice de pointe plus petit car cela compromettrait la structure des blocs allant au fond de la pastille de bloc tissulaire.

Collectez lentement 200 microlitres de tissu. Ajoutez ce tissu dans un flacon cryogénique et passez au suivant jusqu’à ce que tous les flacons soient remplis. Peut avoir besoin d’une règle de 10 minutes.

Placez rapidement le récipient de congélation dans des flacons cryogéniques, un congélateur à moins 80 degrés Celsius, pendant au moins quatre heures ou toute la nuit si le temps est limité. Après suffisamment de temps, sortez le récipient de congélation du congélateur et répartissez les flacons cryogéniques dans une boîte cryogénique le plus rapidement possible. Placez la boîte cryogénique dans un support de boîte d’azote liquide pour un stockage à long terme.

Retirez un cryo-vile de l’azote liquide le plus rapidement possible, en limitant les boîtes cryogéniques L’exposition à la température ambiante fait fondre rapidement l’échantillon en l’immergeant dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Gardez toujours le capuchon au-dessus de l’eau. Vérifiez fréquemment et maintenez le dégel jusqu’à ce qu’une petite glace P soit observée.

Avant de l’apporter dans l’enceinte de sécurité, stérilisez le cryovile avec de l’éthanol à 70 %. Procédez à l’ajout du tissu de décongélation à un grand volume de X-H-B-S-S chaud si le tissu reste sur les parois de la cryo-vile. Collecté délicatement avec HBSS.

Une fois que tous les tissus ont été prélevés. Retournez le tube trois à quatre fois et laissez le tissu se déposer au fond. Cette étape permet d’assurer une dilution suffisante du DMSO.

Une fois que le tissu est installé, aspirez autant de super natin que possible. Ajoutez ensuite 10 millilitres de X-H-B-S-S chaud et frais. Ajoutez 300 microlitres de trypsine à 0,25 % et 50 microlitres d’ADN.

Procédez à la dissociation du tissu avec une légère agitation, créant une suspension cellulaire trouble après la dissociation du tissu. Arrêtez l’activité enzymatique en ajoutant du DM chaud plus 10 % de sérum bovin enrichi EPS cellules de centrifusion à 1200 G pendant cinq minutes. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans du DMEM frais plus 10 % d’EBS et la plaque sur des plaques revêtues de polylysine.

Laissez les cellules se fixer à la vaisselle pendant 30 minutes. Remplacez ensuite le support par du DM frais plus 10 % EBS. Après 24 heures, remplacez le milieu contenu dans le DM par un milieu neurobasal complété par N deux et B 27 et cultivez pendant 10 jours.

Nous venons de détailler un protocole vaste, efficace et fiable avec une préservation de routine des blocs de tissu cortical. Alors bonne chance.