Name: La cryoconservation de tissu cortical Blocs pour la génération des cultures de neurones hautement enrichi (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-11T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Apprenez la cryoconservation de blocs de tissu cortical pour générer des cultures neuronales hautement enrichies. Cette méthode utilise le DMSO et préserve la viabilité cellulaire pour la recherche neurobiologique.

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Cette recherche a été soutenue par des subventions de la recherche Possibilités programme de premier cycle à l&#39;UCI (AR et SP) et des subventions de l&#39;Etat de Californie, l&#39;initiative la maladie d&#39;Alzheimer et les National Institutes of Health accorde pas. HD38466, et le Centre de recherche sur les maladies d&#39;Alzheimer accorde pas. AG16573 (JB)

1. La cryoconservation de tissu cortical Blocks Préparation des matériaux <ol><li> Préparer la solution 1X Hank saline tamponnée (HBSS) en diluant la solution mère à 10X dans de l'eau stérile (1:9). HBSS magasin à 4oC. </li><li> Préparer 10% milieu de congélation du DMSO en diluant DMSO dans HBSS (1:9). Le milieu de congélation doivent être préparées avant la cryoconservation et conservés à 4 ° C jusqu'à refroidissement. </li><li> Une lame de rasoir en acier est utilisé pour le hacher systématique des tissus. Avant l'utilisation, la lame de rasoir est stérilisé par immersion dans l'éthanol à 70% pendant 2 heures. Immédiatement avant le traitement des tissus, rincer la lame de rasoir à l'eau stérile 3 fois. Évitez de laisser le rasoir dans l'eau stérile pour une quantité excessive de temps, car il est sensible à l'oxydation. </li><li> Un conteneur de congélation Nalgene est chargé avec cryotubes (2,5 ml) et ensuite amené dans une armoire biologique stérile. 1 ml de milieu de congélation glacée est ajoutée à chaque flacon. Le conteneur de congélation est alors placé à 4 ° C pendant au moins 2 heures. </li></ol> Nettoyage, découper, et le gel <ol><li> Le tissu cérébral à congeler est nettoyée de la membrane méningée et les vaisseaux sanguins. Utilisez conseils aiguille stérile pour enlever soigneusement les débris du tissu tout en travaillant sur le dessus d'un sac de glace. Tissus nettoyables doivent être rincés doucement avec HBSS froid et transféré à un nouveau plat de Pétri pour hacher. </li><li> Travail sur le dessus d'un sac de glace, utilisez une lame de rasoir stérilisée pour rapidement couper le tissu dans environ 1 mm 3 blocs. Travailler avec de petites portions de tissus nettoyés au temps entraîne un meilleur contrôle sur la procédure de hachage, résultant en des tailles de bloc plus homogène. </li><li> Ajouter lentement les tissus hachés dans 50 ml de HBSS dans un tube conique de 50 ml. Rincer délicatement la boîte de Pétri avec HBSS afin de collecter tous les blocs de tissus restants. Autoriser les blocs de tissus pour descendre au fond du tube, créant un bloc de tissu légèrement tassées à granulés. </li><li> Alors que le tissu est de décantation, mettre le récipient préalablement refroidi congélation et cryotubes dans l'armoire de sécurité biologique. Débouchez toutes les cryotubes de hâter le processus d'ajout de tissu. </li><li> Après tous les blocs de tissus se sont installés, doucement aspirer le HBSS excès, laissant une très fine couche de média-dessus du culot. La centrifugation est déconseillée car elle va provoquer des blocs de tissus d'adhérer les unes aux autres, diminuant de manière significative l'efficacité de congélation. </li><li> Lentement recueillir 200 uL du fond de la dérive des tissus bloc granulés en utilisant la pointe de pipette avec des orifices larges (coupe la pointe avec des ciseaux stériles). Transfert du matériel à un cryovial et de passer à la suivante, des tissus à nouveau la collecte à partir du bas de la pastille. Il est essentiel que la procédure d'attribution des tissus ensemble ne prend pas plus de 3-4 min par conteneur de congélation. Cela garantit que le tissu est exposé à du DMSO pour seulement une courte période de temps avant la congélation. Après le transfert du tissu pour les flacons, placez le récipient dans un gel-80oC congélateur pendant au moins 4 heures. Alternativement, le récipient de congélation peut être laissé une nuit à -80 oC. Répétez ce processus pour tous les conteneurs de congélation restantes. </li><li> Transférer les cryotubes dans le conteneur de congélation (s) à un cryobox et placer dans un réservoir d'azote liquide pour stockage à long terme. </li></ol> 2. La décongélation et la culture de Frozen Blocks tissu cortical Préparation des matériaux <ol><li> Un jour avant le dégel des échantillons de tissus, de poly-L-lysine revêtement boîtes de Petri / lamelles sont préparés. En général, pour les neurones corticaux nous préparons des plats revêtus avec 500 ug / ml ou 1 mg / ml. Ajouter suffisamment d'acide poly-L-lysine solution (faites dans un tampon de borate) pour couvrir entièrement le fond du plat. Si lamelles de verre sont nécessaires, s'assurer qu'ils sont complètement submergés sous la solution de poly-L-lysine. Incuber pendant au moins 12 hr. Avant l'utilisation, rincer la vaisselle avec une généreuse quantité d'eau stérile 3 fois, 5 minutes chacun. </li><li> HBSS chaud est utilisé pour nettoyer les tissus décongelés ainsi que de dissocier le tissu dans des suspensions cellulaires. Le volume de HBSS nécessaire variera en fonction de la quantité de tissu à être décongelés, mais typiquement une cryovial va diluer dans 50 ml de HBSS et seront dissociées dans 10 ml de HBSS. </li><li> Eagle modifié par Dulbecco moyenne avec 10% des suppléments de fer du sérum de veau bovin (EBS) et 1% d'antibiotique / antimycotique (AA) mélange (DMEM (++)) devrait être placé dans un bain à 37 ° C l'eau. </li><li> Milieu d'étalement (NB (+++)) doivent être préparées avant l'utilisation. Ce milieu est préparé en ajoutant 1% d'antibiotique / antimycotique ainsi B27 et les compléments de N2. </li></ol> Remarque: Les noms des médias en annexe avec des croix (+) indique l'inclusion d'additifs à la composition de base des médias. Dans ce texte, DMEM (+ +) indique DMEM plus 10% EBS majoré de 1% AA, tandis NB indique (+++) NB plnous 1% AA et B27 ainsi que N2. La décongélation et la culture <ol><li> Retirez les cryotubes du réservoir d'azote liquide et de dégel rapide à 37 ° C dans un bain d'eau glacée jusqu'à ce que seul une petite pastille est observée à l'intérieur du contenu du flacon. </li><li> Délicatement le transfert le contenu du flacon de 50 ml de HBSS au chaud dans un tube conique. Utiliser un embout large orifice pour doucement déloger les blocs de tissus restent coincés dans le cryovial. Inverser le tube 3-4 fois et laissez le tissu à recueillir lentement vers le bas. Les tissus doivent régler rapidement, mais si les blocs sont trop petits cela peut ne pas se produire et la lumière de centrifugation (~ 200 x g) est recommandée. </li><li> Aspirer HBSS excès. </li><li> Ajouter 10 ml de HBSS chaude pour le tissu et de culot 300 pi de trypsine à 0,25% et de 50 uL d'ADNase. Incuber dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 5 min, puis placer dans un agitateur orbital à 80 rpm jeu et 37 ° C pendant 5 minutes supplémentaires. </li><li> Après cette période, amener les blocs de tissus dans une enceinte de sécurité biologique et l'utilisation d'une pipette 10 ml de bien agiter le blocs de tissus jusqu'à une suspension de cellules trouble est formé. Désactiver la trypsine en ajoutant 10 ml de DMEM chaude (+ +) à la suspension cellulaire. </li><li> Centrifuger les cellules dissociées à 1200 x g pendant 5 min. Aspirer et jeter le surnageant, resuspendre le culot cellulaire dans 10 ml d'eau tiède DMEM (+ +) et de quantifier le nombre de cellules en utilisant un hématimètre. </li><li> Cellules de la plaque de poly-L-lysine plats revêtus. Typiquement, un plat de 60 mm sera plaqué avec 1x10 6 cellules. </li><li> Laisser les cellules d'attacher au plat / lamelles d'environ 1 h dans l'incubateur de culture tissulaire. Il est recommandé de suivre les progrès de l'attachement dans une plaque toutes les 10 min jusqu'à ce l'attachement effectif est observé. Puis, doucement remplacer le milieu avec du DMEM frais (++). </li><li> Après 24 h, remplacer le DMEM (+ +) avec les chaudes NB (+++). Changements de milieu partielle (50%) sont effectuées tous les 5 jours avec frais NB (+++). Cultures saines montrent habituellement des signes de différenciation et de croissance des processus après 24 heures. Dans ces conditions, et effectuer des changements partiels moyenne tous les 4-5 jours, les cultures peuvent être maintenues pendant des périodes prolongées jusqu'à 4-6 semaines. </li><li> Pour la génération des cellules précurseurs neuronales (CPN), un protocole similaire est utilisé à l'exception que, après centrifugation, DMEM sans EBS est utilisé. Les cellules sont étalées dans le T-25 flacons de DMEM/F12 (1:3) complété avec B27 et l'EGF (20 ng / ml) pour permettre la formation d'neuropheres. Pour différencier les PNJ, neurosphères sont étalées sur la laminine (10 ug / ml) recouvert de lamelles de DMEM/F12 (1:3) milieu supplémenté avec N2. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs Cultures saines montrera une croissance importante et de différenciation après 5 jours post-décongélation et seront généralement stabiliser dans sa croissance en 10 jours (figure 1). Coloration Immuncocytochemical de ces cultures révèle de nombreux astrocytes (figure 2A) et les neurones (figure 2B) pour les humains et les rats des cultures primaires de neurones. Ce protocole est également approprié pour la génération de PNJ que flottant neurosphères (figure 3A), qui dans des conditions de différenciation, le résultat dans les cultures mixtes de haute qualité (figure 3B, C). <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Des cultures cellulaires de tissu cortical humain congelé. Frozen humaine blocs de tissus corticaux sont décongelées et plaquées sur la poly-lysine lamelles couché et cultivées pendant 10 jours. Dès le jour 5 expansion cellulaire est apparente et par jour 10 confluence est atteinte. Barre d'échelle: 100 um. <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Coloration immunocytochimique de cultures cellulaires. (A) Les cultures ont été colorés avec le marqueur protéine gliale acide fibrillaire gliale (GFAP, flèches épaisses). (B) Les neurones ont été détectés avec le marqueur neuronal bêta-tubuline III (TIII, flèches fines). (C) Les deux rats et des cultures humaines montrent gliales et neurones abondante après 10 jours de culture. Anticorps primaire: la souris anti-GFAP (1:1000) et de lapin anti-TIII (1:1000). Anticorps secondaire: anti-souris Alexa 594 (1:500) et anti-lapin Alexa 488 (1:500). Coloration des noyaux: Hoestch bleue (1:1000). Barre d'échelle: 50 um. <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Génération de neurosphères. (A) des tissus congelés a été traitée comme décrit ci-dessus et a permis de se propager comme neurosphères. (B) neurosphères ont été étalées sur des lamelles de verre dans des conditions de différenciation et cultivées pendant 10 jours, ce qui entraîne la migration des cellules loin de la Neurosphère. (C) Les deux neurones et les astrocytes sont présents dans la frange d'une expansion Neurosphère différencier. Contre-coloration nucléaire, les anticorps primaires et secondaires utilisés comme dans la figure 2.

<ol><li>Robbins, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of human brain tissue.</a> Exp Neurol. 107, 208-213 (1990).</li>
<li>Ware, C. B., Nelson, A. M., Blau, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled-rate+freezing+of+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Controlled-rate freezing of human ES cells.</a> Biotechniques. 38, 879-880 (2005).</li>
<li>Paynter, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+practical+issues+for+cryopreservation+of+nerve+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Principles and practical issues for cryopreservation of nerve cells.</a> Brain Res Bull. 75, 1-14 (2008).</li>
<li>Thirumala, S., Gimble, J. M., Devireddy, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+stromal+vascular+fraction+of+adipose+tissue+in+a+serum-free+freezing+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of stromal vascular fraction of adipose tissue in a serum-free freezing medium.</a> J Tissue Eng Regen Med. 4, 224-232 (2010).</li>
</ol>

Cryoconservation offre une opportunité précieuse à la banque d&#39;échantillons de tissus du cerveau pour une utilisation future. Nous décrivons ici un protocole simple mais efficace pour générer deux neurones enrichi les cultures et les cellules précurseurs des neurones à partir des blocs congelés tissu cérébral. Cette procédure évite les coûts économiques des techniques de cryoconservation traditionnelles qui utilisent plus cher vitesse contrôlée congélateurs. Le protocole permet la génération de cultures de neurones viables après décongélation en fournissant un moyen rapide et efficace pour geler les blocs de tissus. Le processus de congélation entier peut prendre aussi peu que 20 minutes. En plus de cultures neuronales primaires, en utilisant cette méthode de blocs de tissus peuvent également être décongelés à générer des PNJ grandi comme libre neurosphères flottant. À cet égard, le manque de sérum dans notre milieu de congélation assure que les cellules sont conservés dans un état indifférencié. Dans des conditions de différenciation, neurosphères produite à partir de l&#39;expansion des tissus congelés et montrent des taux de différenciation très comparable à neurosphères générés à partir de tissus frais.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;milieu de culture de Dulbecco (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11995-073</td><td>Glucose élevé 1X</td></tr><tr><td>Sérum de veau bovin supplémenté</td><td>Hyclone</td><td>SH30072.03</td><td>Pour le milieu de culture </td></tr><tr><td>Milieu Neurobasal-A (1X), liquide</td><td>Invitrogen</td><td>1088-022</td><td></td></tr><tr><td>Supplément B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Supplément pour milieu Neurobasal</td></tr><tr><td>Supplément N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Supplément pour milieu Neurobasal</td></tr><tr><td>Trypsine (10X)</td><td>Cellgro</td><td>25-054CI</td><td>Dissociation tissulaire</td></tr><tr><td>Désoxyribonucléase 1 provenant du pancréas de bovin (DNase)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527-30KU</td><td>Dissociation tissulaire</td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) (10X)</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>14065</td><td>Tissu de nettoyage, lavages et milieu de congélation</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine - 500 mg</td><td>Invitrogen</td><td>P2636</td><td>Substrat pour l'adhérence des cellules neuronales</td></tr><tr><td>antibiotique-antimycotique (100X), liquide</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Pour éviter la contamination</td></tr><tr><td>Pointes de pipette à orifice large (1-200 µl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-141</td><td>Pour éviter les contraintes de cisaillement sur les cellules</td></tr><tr><td>Pointes de pipette graduées (101-1000 µl)</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1111-2721</td><td></td></tr><tr><td>21 aiguilles de repérage de précision G1</td><td>BD Biosciences</td><td>305165</td><td>Pour nettoyer le tissu</td></tr><tr><td>pipette de 10 ml </td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1071-0810</td><td>Individuellement emballé</td></tr><tr><td>Tubes de 50 ml</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>926-9-04</td><td></td></tr><tr><td>Lame de rasoir à tranchant unique</td><td>Smith &amp;amp; Nephew Inc.</td><td>67-0238</td><td>Pour hacher le tissu</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri en polystyrène de 60 x 15 mm </td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>8609-0160</td><td>Pour la culture générale</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri en polystyrène, 100 x 15 mm </td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>8609-0010</td><td>Pour le nettoyage des tissus</td></tr><tr><td>Boîte cryogénique </td><td>Nalge Nunc international</td><td>5026-1010</td><td></td></tr><tr><td>Contenant de congélation</td><td>Nalge Nunc international</td><td>5100-0001</td><td>&quot;M. Frosty&quot;</td></tr><tr><td>Vials cryogéniques de 2,0 ml</td><td>Nalge Nunc international</td><td>5012-0020</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td>Pour le milieu de congélation</td></tr><tr><td>Éthanol 200 degrés</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>Pour stériliser la lame de rasoir</td></tr></tbody></table>

la cryoconservation de tissu cortical blocs pour la génération des cultures de neurones hautement enrichi

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

Dans cette étude, nous présentons un protocole standardisé pour la cryoconservation et la décongélation de succès corticale blocs de tissus du cerveau pour générer hautement enrichi cultures neuronales. Pour ce protocole le milieu de congélation utilisé est de 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO) dilué dans une solution saline tamponnée de Hank (HBSS). Les blocs de tissu cortical sont transférés à cryotubes contenant le milieu de congélation et lentement congelés à -1 ° C / min dans un récipient vitesse contrôlée de congélation. Post-traitement de dégel et de la dissociation des blocs de tissus congelés systématiquement produit des cultures enrichies en neurones, qui a affiché une croissance neuritique rapide au cours des 5 premiers jours de culture et de l&#39;expansion importante du réseau neuronal dans les 10 jours. Coloration immunocytochimique avec le marqueur protéique astrocytaire acide fibrillaire gliale (GFAP) et le marqueur de neurones bêta-tubuline de classe III, a révélé un nombre élevé de neurones et les astrocytes dans les cultures. Génération de neurones cultures de cellules précurseurs de tissus après la dissociation conduit à bloquer en pleine expansion neurosphères, qui a produit un grand nombre de neurones et les astrocytes dans des conditions de différenciation. Ce protocole de cryoconservation simple permet de rapides, de conservation efficace et peu coûteux de corticale blocs de tissus du cerveau, qui accorde une flexibilité accrue pour la production ultérieure de neurones, astrocytes, neurones et les cultures de cellules précurseurs.

Ici, nous décrivons une méthode pour la cryoconservation efficace et dégel du cortex cérébral des blocs de tissus pour générer hautement enrichi cultures neuronales. Ce protocole simple fournit la flexibilité pour la génération plus tard, des neurones, des astrocytes et des cultures de cellules neuronales précurseur.

La cryoconservation de tissu cortical Blocs pour la génération des cultures de neurones hautement enrichi

Dans cette étude, nous décrivons un protocole standardisé pour la cryopréservation et la décongélation réussies de blocs de tissu cérébral cortical afin de générer des...

Bonjour, je m'appelle Alan et je travaille dans le laboratoire du Dr Horney Lu à l'Université de Californie à Irvine, au sein du Département de neurobiologie et de comportement. Et moi, c'est Bob. Aujourd'hui, le Dr Haro va vous présenter un protocole rapide, efficace et fiable pour la cryoconservation routinière de blocs de tissu cortical, en vue de l'obtention ultérieure de cultures primaires de neurones de haute qualité.Commençons donc. Le tissu nettoyé et haché est chargé dans des cryotubes contenant un milieu de congélation à 10 % de TMSO.Les cryotubes sont chargés dans un conteneur de congélation puis placés à moins 80 degrés Celsius pendant au moins quatre heures. Les cryotubes congelés sont ensuite placés dans de l'azote liquide pour une conservation à long terme. Pour la culture, le cryotube AC est décongelé dans un bain d'eau tiède et rincé avec du HBSS tiède afin d'éliminer le DMSO résiduel.Un HBSS frais est ajouté avec de la trypsine pour la dissociation, puis du DMM contenant 10 % de SBE est ajouté. Pour arrêter l'activité enzymatique dissociative, les cellules sont centrifugées et le culot est resuspendu dans du DMM frais supplémenté de 10 % de SBE, puis ensemencé dans des boîtes pré-enduites de polylysine. Après 24 heures, le DMM est remplacé par un milieu neurobasal enrichi et les cellules sont cultivées pendant 10 jours.Ce protocole utilise une lame de rasoir en acier pour découper le tissu cortical avant utilisation. La lame doit être stérilisée dans de l'éthanol à 70 % pendant au moins deux heures. Une solution saline tamponnée au Hank (HBSS) à 1 x est préparée en diluant une solution mère 10 x dans de l'eau stérilisée ; la solution HBSS à 1 x est ensuite conservée sur de la glace ou à quatre degrés Celsius jusqu'au traitement du tissu.L'oxyde de diméthylsulfure ou DMSO est utilisé comme agent cryoprotecteur dans le milieu de congélation. Ce protocole utilise une dilution volumétrique de 10 % de DMSO dans un volume d'H-B-S-S-D-M-S-O ; le mélange doit être complet avant stockage à quatre degrés Celsius. Un contenant de congélation Nalgene est utilisé pour contrôler la vitesse de congélation des échantillons.Le conteneur de congélation est chargé avec des cryotubes de 2,5 millilitres préalablement étiquetés. Il est également conseillé d'étiqueter les conteneurs de congélation eux-mêmes si vous en utilisez plusieurs, et de noter le conteneur correspondant sur la bile. Le milieu de congélation contenant 10 % de DMSO, préalablement refroidi, ainsi que le conteneur de congélation, sont introduits dans une cabine de sécurité biologique stérile.Ici, un millilitre de milieu de congélation est lentement ajouté à chacun des cryotubes. Après s'être assuré que les bouchons sont bien fermés, placer le contenant de congélation avec les tubes à quatre degrés Celsius pendant au moins deux heures, juste avant le traitement du tissu. La lame de rasoir préalablement stérilisée doit être rincée soigneusement. Trois lavages de trois minutes chacun.L'utilisation d'eau stérilisée devrait suffire à éliminer tout éthanol résiduel. Cette procédure de lavage doit être rapide, car le rasoir est sujet à l'oxydation en cas d'immersion prolongée dans l'eau stérile. Avant le nettoyage, le tissu doit être placé sur une poche de glace.Rincez légèrement à l’eau froide X-H-B-S-S pour éliminer tous les débris libres. Des aiguilles stérilisées sont utilisées pour nettoyer les fragments de tissu de toute membrane ou vaisseau sanguin résiduel. Il est essentiel de préserver l’intégrité structurelle du tissu pendant le nettoyage.À mesure que cela augmentera, l'efficacité de la découpe du tissu propre sera visiblement différente de celle du tissu brut et devrait présenter la majorité des membranes ou des vaisseaux sanguins retirés. Une fois le tissu nettoyé et rincé, la découpe peut commencer. Il est important d'effectuer des incisions nettes du tissu afin de former des blocs d'environ un millimètre cube de taille.Des blocs trop gros entraînent un rendement cellulaire plus faible au dégel. Les blocs plus petits, toutefois, doivent également éviter une surtransformation. Les tissus hachés peuvent être recueillis à l’aide d’une pipette automatique et d’un peu de milieu X-H-B-S-S frais.Veillez à rincer la boîte avec du HBSS afin de récupérer tous les tissus collectés. Le tissu est ensuite ajouté à un grand volume de HBSS 1X et laissé tomber au fond, formant un culot lâche. Cela permet d'éliminer tous les débris résiduels présents pendant que le tissu sédimente dans le HBSS. Récupérez le récipient de congélation préalablement refroidi et les cryotubes avant de répartir le tissu.Veillez à retirer les bouchons de tous les flacons afin d'accélérer le processus de remplissage des échantillons de tissu. L'exposition au DMSO à température ambiante ne doit pas dépasser 10 minutes. Il est conseillé de travailler avec un seul contenant de congélation à la fois, jusqu'à ce que tout le tissu soit utilisé.Commencez par aspirer le surnageant d'un tissu lâche, en vous rapprochant au maximum du culot sans le perturber. Ensuite, fixez une pointe de 200 microlitres à orifice large sur une pipette. N'utilisez pas de pointe à orifice plus petit, car cela compromettrait la structure des blocs qui se déposent au fond du culot de tissu.Prélvez 200 microlitres de tissu lentement. Ajoutez ce tissu à un tube cryogénique et passez au suivant jusqu'à ce que tous les tubes soient remplis. Une règle de 10 minutes pourrait être nécessaire.Placer rapidement le conteneur de congélation dans des cryotubes et entreposer ceux-ci dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pendant au moins quatre heures, ou toute la nuit si le temps est limité. Après un temps suffisant, retirer le conteneur de congélation du congélateur et répartir les cryotubes dans une boîte cryogénique aussi rapidement que possible. Placer la boîte cryogénique dans un support de boîte à azote liquide pour un stockage à long terme.Retirer une ampoule cryogénique de l'azote liquide le plus rapidement possible, en limitant l'exposition des boîtes cryogéniques à la température ambiante, puis faire fondre rapidement l'échantillon en l'immergeant dans un bain d'eau à 37 degrés Celsius. Garder toujours le bouchon au-dessus du niveau de l'eau. Vérifier fréquemment et poursuivre le décongélation jusqu'à l'observation d'un petit morceau de glace.Avant de l'apporter dans l'enceinte de sécurité, stérilisez le flacon cryogénique avec de l'éthanol à 70 %. Procédez ensuite à l'ajout du tissu décongelé dans un grand volume de HBSS tiède à une fois, si du tissu reste sur les parois du flacon cryogénique. Récupérez délicatement avec du HBSS.Une fois que tous les tissus ont été collectés, retournez le tube trois à quatre fois et laissez le tissu se déposer au fond. Cette étape garantit une dilution suffisante du DMSO.Une fois le tissu déposé, aspirez autant que possible le surnageant. Ajoutez ensuite 10 millilitres de H-B-S-S frais et chaud à 1 X. Ajoutez 300 microlitres de trypsine à 0,25 % et 50 microlitres d'ADN. Procéder à la dissociation du tissu par agitation douce, afin d'obtenir une suspension cellulaire trouble une fois le tissu dissocié. Arrêter l'activité enzymatique en ajoutant du DM chaud plus 10 % de sérum bovin enrichi EPS, puis centrifuger les suspensions cellulaires à 1200 ×g pendant cinq minutes. Resuspendre le culot cellulaire dans du DMEM frais plus 10 % de SBE et ensemencer sur des plaques revêtues de polylysine.Laisser les cellules s’attacher aux boîtes pendant 30 minutes. Ensuite, remplacer le milieu par du DM frais additionné de 10 % de SBE. Après 24 heures, remplacer le milieu contenant du DM par un milieu neurobasal supplémenté avec N deux et B 27, puis faire croître pendant 10 jours.Nous venons de détailler un protocole vaste, efficace et fiable associé à une cryopréservation de routine de blocs de tissu cortical. Bonne chance.

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Cette vidéo montre la méthode de culture de neurones embryonnaires cryoconservés, impliquant une décongélation contrôlée, une dilution avec un milieu neurobasal et un ensemencement sur une plaque recouverte de poly-L-lysine. L’incubation ultérieure favorise la croissance et le maintien des connexions neuronales.

Génération d’une culture de neurones primaires de faible densité à partir de neurones embryonnaires congelés

Nous présentons ici un protocole pour Ca2 + l’imagerie dans les neurones et les cellules gliales, qui permet la dissection de Ca2 + signaux à résolution subcellulaire. Ce processus s’applique à tous les types de cellules qui permettent l’expression des indicateurs génétiquement codés de Ca2 + .

Dissection des signaux locaux Ca2 + dans les cellules cultivées par axés sur la Membrane Ca2 + indicateurs

Présenté ici est un protocole pour la génération spontanée de neurosphères enrichies dans les cellules progénitrices neurales des neurones plaqués de haute densité. Au cours de la même expérience, lorsque les neurones sont plaqués à une densité plus faible, le protocole entraîne également des cultures de neurones de rat primaire prolongées.

Génération de neurosphères à partir de neurones hippocampes et corticales primaires mixtes isolées de l'embryon de rat Sprague Dawley E14-E16

Ici, nous présentons une approche simple utilisant des milieux de culture spécifiques qui permettent l’établissement de cultures enrichies de neurones et d’astrocytes, ou de cultures neuron-glia du cortex embryonnaire, avec un rendement élevé et une reproductibilité.

Un modèle de culture cellulaire pour étudier le rôle des interactions neurone-glia dans l’ischémie

Dans cette étude, nous fournissons une technique détaillée pour un système de culture organoïde corticale simple mais robuste utilisant des cultures hPSC standard sans mangeoire. Il s’agit d’un protocole rapide, efficace et reproductible pour générer des organoïdes qui modélisent les aspects de la sénescence cérébrale in vitro.

Génération robuste et hautement reproductible d’organoïdes cérébraux corticaux pour la modélisation de la sénescence neuronale cérébrale in vitro

Un stock congelé de neurones prêt à l’emploi est un outil puissant pour évaluer les fonctions synaptiques. Ici, nous introduisons une culture primaire facile à faible densité à partir de stock congelé à l’aide d’une plaque de 96 puits.

Culture primaire de faible densité facile et reproductible utilisant un stock congelé de neurones embryonnaires de l’hippocampe

Apprenez la cryoconservation de blocs de tissu cortical pour générer des cultures neuronales hautement enrichies. Cette méthode utilise le DMSO et préserve la viabilité cellulaire pour la recherche neurobiologique.

La cryoconservation de tissu cortical Blocs pour la génération des cultures de neurones hautement enrichi

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