Isolement de vésicules extracellulaires bactériennes à l’aide de la chromatographie d’exclusion stérique

Prenez une chromatographie d’exclusion stérique ou une colonne SEC remplie de billes de résine poreuse de taille définie. Il contient un réservoir d’échantillons au sommet.

Ajoutez une solution saline tamponnée au phosphate ou du PBS pour équilibrer les billes de la colonne et jetez le flux.

Chargez un filtrat de culture bactérienne concentré qui contient des vésicules extracellulaires ou VE, des protéines sécrétées et des contaminants.

Les VE sont des nanovésicules à base de lipides qui transportent des molécules bioactives et sont sécrétées par des bactéries.

Une fois que le filtrat pénètre dans les billes, ajoutez du PBS pour le faire passer à travers le lit de résine.

Jeter l’éluat initial contenant de gros contaminants non vésiculaires.

Placez un tube de collecte sous la sortie et ajoutez séquentiellement du PBS.

Les VE de grande taille évitent les pores de résine plus petits, se déplacent à travers les espaces interparticulaires entre les billes et éluent en premier.

Les protéines et les contaminants plus petits pénètrent dans les pores, suivent des chemins plus longs et éluent plus tard.

Collecter les fractions à élution précoce contenant des VE et les stocker pour analyse.

Pour l’isolement des VE, effectuez une chromatographie d’exclusion stérique, ou SEC, à l’aide d’une petite colonne avec un volume de lit de 10 millilitres pour moins de 100 millilitres de matériau de départ et d’une colonne plus grande avec un volume de lit de 47 millilitres pour plus de 100 millilitres de matériau de départ. Pendant plusieurs heures avant l’expérience, amenez la colonne SEC et le PBS à température ambiante, puis stabilisez la colonne en position verticale à l’aide d’un support de laboratoire standard et d’un support. Avant de vous connecter à la colonne SEC, hydratez le réservoir d’échantillon en laissant cinq millilitres de PBS s’écouler à travers la fritte dans un conteneur à déchets.

Ensuite, dévissez le capuchon d’entrée de la colonne pour ajouter deux millilitres de PBS dans le réservoir d’échantillon et connectez soigneusement le réservoir à la colonne pendant que le PBS s’égoutte à travers la fritte. Pour l’équilibrage de la colonne, ajoutez 47 millilitres de PBS dans le réservoir d’échantillon, puis débouchez le bas de la colonne SEC. Ensuite, laissez tout le tampon d’échantillon chargé s’écouler à travers la colonne et ignorez le flux.

Après avoir chargé deux millilitres de l’échantillon dans le réservoir d’échantillon, laissez l’échantillon entrer complètement dans la colonne et recueillir le flux. Ajouter immédiatement le PBS dans le réservoir d’échantillon à un volume de 14,25 millilitres moins le volume de l’échantillon pour permettre à la solution de s’écouler à travers la colonne, tout en éliminant la quantité égale au volume de vide de la colonne. Ensuite, placez un microtube de deux millilitres à faible liaison directement sous la colonne SEC pour recueillir le premier flux ou fraction après avoir laissé deux millilitres de PBS traverser la colonne.

Continuez à ajouter deux millilitres de PBS dans le réservoir d’échantillon pour recueillir chaque fraction suivante. Stockez les fractions collectées à quatre degrés Celsius pour un stockage à court terme ou à moins 80 degrés Celsius pour un stockage à long terme.