Évaluation de la filamentation induite par les antibiotiques chez E. coli à l’aide du dosage du placage et de la cytométrie en flux

Commencez par une culture d’E. coli prétraitée avec un antibiotique.

Cet antibiotique bloque la division cellulaire, ce qui entraîne la formation de cellules filamenteuses allongées avec une teneur accrue en ADN.

Déposer une partie de la culture sur une plaque de gélose riche en nutriments et incuber.

Les cellules filamenteuses ne se divisent pas malgré une croissance continue ; Seules les cellules non filamenteuses forment des colonies, ce qui entraîne un faible nombre de colonies.

Diluez la culture bactérienne restante et ajoutez un colorant fluorescent de liaison à l’ADN. Ensuite, incubez dans l’obscurité.

Le colorant pénètre dans les cellules et se lie à l’ADN.

Vortex l’échantillon, puis passez-le dans un cytomètre en flux.

La quantité de lumière diffusée par chaque cellule correspond à sa taille.

De même, la fluorescence émise par les acides nucléiques liés aux colorants indique le contenu en ADN bactérien.

Les cellules traitées aux antibiotiques présentent une diffusion et une fluorescence accrues, reflétant une croissance filamenteuse et une réplication continue de l’ADN sans division.

Cela démontre des modifications de la physiologie bactérienne causées par les antibiotiques inhibiteurs de la division cellulaire.

Préparez des dilutions en série de dix fois, jusqu’à 10 puissance moins septième, des 200 microlitres d’échantillon de culture dans un milieu frais.

Mélanger entre chaque dilution par vortex très doux ou en inversant le tube. Déposer 100 microlitres de la dilution appropriée sur des plaques d’agarose LB non sélectionnées et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, comptez le nombre de colonies pour déterminer la concentration de cellules viables dans chaque échantillon de culture.

Tracez l’UFC par millilitre en fonction du temps pour les cultures cellulaires non traitées et traitées. Mesurez la DO 600 de la culture sur un spectrophotomètre. Diluer l’échantillon de culture avec un milieu frais à quatre degrés Celsius pour obtenir un échantillon avec une OD 600 à 0,06, correspondant à environ 15 000 cellules par microlitre.

Pour la coloration de l’ADN, mélangez l’échantillon bactérien dilué avec une solution de 10 microgrammes par millilitre de colorant fluorescent d’ADN dans un rapport de volume de un à un et incubez dans l’obscurité pendant 15 minutes. Avant l’injection de l’échantillon, mélangez l’échantillon par vortex très doux ou en inversant le tube. Faites passer l’échantillon dans le cytomètre en flux à un débit d’environ 120 000 cellules par minute.

Obtenez de la lumière diffusée vers l’avant et latéralement ainsi que du colorant fluorescent d’ADN/signal fluorescent avec les paramètres appropriés.