Visualisation de la résistance bactérienne à l’aide de sondes antibiotiques fluorescentes

Les antibiotiques étiquetés fluorescents sont des outils puissants qui peuvent être utilisés pour étudier de multiples aspects de la résistance aux antimicrobiens. Cet article décrit la préparation des antibiotiques fluorescents marqués et leur application à l’étude de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries. Les sondes peuvent être utilisées pour étudier les mécanismes de résistance bactérienne (p. ex., efflux) par spectrophotométrie, cytométrie du débit et microscopie.

La préparation d’antibiotiques fluorescents permet d’évaluer la localisation de ces reagents thérapeutiques chez les bactéries au moyen de techniques d’analyse pratiques telles que la spectrophotométrie et la microscopie. Le principal avantage de cette technique est la facilité avec laquelle la localisation antibiotique peut être déterminée. Cette localisation est pertinente pour un certain nombre de phénomènes dont l’efflux.

Pour effectuer la procédure de réaction de clic A, placez l’antibiotique d’azide d’intérêt dans un flacon inférieur rond et ajoutez 25 millilitres de tert-butanol et 25 millilitres d’eau par millimole d’azide au flacon. Ajouter le fluorophore alkyne préparé à la solution et chauffer la réaction à 50 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 0,6 équivalent de sulfate de cuivre et 2,4 équivalents d’acide ascorbique au flacon.

Remuer la réaction pendant une heure ou jusqu’à ce que l’analyse par LCMS indique l’achèvement de la réaction. Puis refroidir et purifier la réaction au besoin pour l’échafaudage antibiotique. Ici, la réaction clé de chimie de clic pour la préparation des antibiotiques fluorescents avec des exemples de la structure synthétisée des antibiotiques correspondants par l’intermédiaire d’un intermédiaire d’azide basé sur la ciprofloxacine, le linezolid, et le trimethoprim sont montrés.

Dans ces traces de spectrométrie de masse de chromatographie liquide d’un azide de ciprofloxacine et d’une réaction de clic d’alkyne de NBD, l’azide a été éludé à 3.2 minutes et le produit a été éludé à 3.8 minutes. La progression de la réaction de clic peut être suivie par la disparition du pic d’azide. Dans ces spectres, l’impact de la purification peut être visualisé avec des pics erronés disparaissant.

Pour évaluer l’activité antimicrobienne de l’antibiotique synthétisé, stries stocks de glycérol de souches bactériennes appropriées pour l’échafaudage antibiotique sur les plaques d’agar LB et de cultiver les cultures pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain matin, choisissez une seule colonie de chaque assiette et de la culture des colonies pendant la nuit en cinq millilitres de CAMHB par culture à 37 degrés Celsius. Le lendemain, diluer les cultures environ 40 fois en CAMHB frais et faire croître les bactéries à mi-phase de notation avec une densité optique à 600 nanomètres entre 0,4 et 0,8.

Ensuite, préparez des solutions de stock de chaque antibiotique fluorescent à 1,28 milligramme par millilitre dans du sulfoxyde de diméthyle à 20 % dans l’eau stérile et ajoutez 10 microlitres d’antibiotiques à chaque puits de la première colonne d’une plaque de 96 puits. Ajouter 90 microlitres de CAMHB à chaque puits de la première colonne et 50 microlitres à tous les autres puits. Ensuite, effectuez une dilution en série double à travers la plaque.

Après avoir bien mélangé, diluer les cultures de phase de rondins intermédiaires à environ une fois 10 à la sixième colonie formant des unités par millilitre et ajouter 50 microlitres de chaque culture aux puits de dilution pour obtenir une concentration finale d’environ cinq fois 10 à la cinquième colonie formant des unités par millilitre. Lorsque toutes les bactéries ont été plaquées, placez les couvercles sur les plaques et incubez les cultures pendant 18 à 24 heures à 37 degrés Celsius sans trembler. Le lendemain, inspectez visuellement les plaques.

La concentration minimale d’inhibition sera le puits de concentration le plus bas sans croissance visible. Pour l’analyse de l’accumulation de sondes, stries de stocks de glycérol des souches bactériennes sur les plaques d’agar LB pour une incubation d’une nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain matin, choisissez une seule colonie de la plaque pour la culture de nuit dans le bouillon de lysogeny à 37 degrés Celsius.

Le lendemain matin, diluer la culture de nuit environ 50 fois dans le milieu frais. Lorsque la culture atteint la phase médiane du rondin, pelleter les bactéries par centrifugation et décanter le milieu. Resuspendez les bactéries dans un millilitre de PBS et centrifugez à nouveau les bactéries.

Décanter le supernatant et resuspendre la pastille lavée dans PBS à une densité optique à 600 nanomètres de deux. Ajouter 10,1 microlitres de 10 milli molaires CCCP en PBS à un millilitre de bactéries et incuber les bactéries à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. À la fin de l’incubation, recueillir les bactéries par centrifugation et resuspendre la pastille en un millilitre de 10 à 100 micromolaire solution antibiotique fluorescente dans PBS.

Après une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius, lavez les cellules par centrifugation quatre fois en un millilitre de PBS froid par lavage. Après le lavage, lyse les bactéries avec 180 microlitres de tampon de lyse et 70 microlitres de lysozyme. Après 30 minutes à 37 degrés Celsius, congelez-décongelez les bactéries trois fois à moins 78 degrés Celsius pendant cinq minutes et 34 degrés Celsius pendant 15 minutes respectivement.

Après la dernière période de gel-dégel, sonifier l’échantillon pendant 20 minutes, suivi d’une incubation de 30 minutes à 65 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, recueillir l’échantillon lysé par centrifugation et filtrer le contenu du tube à travers une membrane filtrante de 10 kilodaltons. Lavez le filtre quatre fois avec 100 microlitres d’eau par lavage et aliquot chacun se laver dans les puits individuels d’une plaque noire à fond plat de 96 puits.

Mesurez ensuite l’intensité de fluorescence sur un lecteur de plaque avec des longueurs d’onde d’excitation et d’émission appropriées au fluorophore. Ces résultats typiques de l’évaluation de l’accumulation intracellulaire par spectroscopie de fluorescence en présence et en l’absence d’efflux montrent que la fluorescence intracellulaire des bactéries est significativement plus élevée après le pré-traitement avec cccp indiquant que l’efflux réduit l’accumulation dans les bactéries. Dans ces images confocales représentatives de microscopie des bactéries gram positives et gram négatives, la localisation de l’antibiotique dans les bactéries peut être visualisée après traitement de CCCP.

Ce phénomène n’est pas observé lorsqu’aucun CCCP n’est ajouté. Lorsque vous utilisez des antibiotiques fluorescents, soyez conscient des informations que vous visez à recueillir et assurez-vous de considérer quel protocole sera le plus utile lors de l’obtention de ces données. Après leur synthèse, les antibiotiques fluorescents peuvent être utilisés pour étudier un certain nombre de processus bactériens, y compris les interactions médicamenteuses cibles et les modifications de résistance.