Analyse de la stabilité des plasmides avec la microfluidique de gouttelettes open source

Un flux de travail microfluidique accessible et open-source est présenté pour l’analyse parallélisée de la rétention plasmidique chez les bactéries. En utilisant la microscopie à fluorescence pour quantifier la présence de plasmides dans des microcolonies unicellulaires au sein de microgouttelettes de gel, cette méthode offre une alternative précise, accessible et évolutive au comptage traditionnel sur plaque.

Nous développons des méthodes de CI microphiles à haut débit pour étudier la diversité des populations cellulaires et les interactions cellule-cellule. Dans ce contexte, les microgouttelettes de gel nous permettent d’effectuer des étapes de protocole utiles, comme la manipulation de l’ADN par coloration par lyse et la microscopie de manière fortement paralysée dans les cellules piégées. Les flux de travail microphiles Droplet sont connus pour leur débit ultra-élevé et leur polyvalence, mais leur adoption est souvent limitée par le besoin d’instruments haut de gamme et d’une expertise spécialisée.

Notre protocole améliore les techniques traditionnelles en utilisant une analyse à haut débit de cellules uniques avec coloration fluorescente et un flux de travail de microscopie open source accessible. Il encapsule les cellules dans des microgouttelettes de gel via la microfluidique pour analyser simultanément les minicellules et les microcolonies. Alors que les cultures en vrac et en plaques manquent de spécificité et de résolution, cette méthode permet d’obtenir des statistiques précises et représentatives de divers phénomènes.

Nos protocoles combinent la microfluidique à gouttelettes, la microscopie fluorescente et le matériel open source dans une méthode basée sur l’étiquetage. Cette approche rend l’analyse unicellulaire plus flexible et plus abordable, ce qui permet à la communauté scientifique de répondre à des questions scientifiques complexes concernant les communautés microbiennes. Pour commencer, chauffez de l’agarose à ultra-basse température à une concentration de 2 % à 90 degrés Celsius dans du bouillon Luria Bertani, ou LB.

Agitez le mélange pendant 10 minutes dans un agitateur à température contrôlée, puis réduisez la température du thermo-shaker à 39 degrés Celsius pour refroidir la solution d’agarose. Placez le tube de suspension d’Escherichia coli dans le shaker thermique pendant quatre minutes pour le réchauffer à 39 degrés Celsius. Mélangez la suspension de bactéries et la solution d’agarose dans un rapport de un pour un pour obtenir une concentration d’agarose de 1 % avec une suspension cellulaire de 3,1 fois 10 à la puissance six cellules par millilitre.

Préparez la solution de contrôle négatif pour la surveillance de la contamination à l’aide de LB et d’une suspension d’agarose dans un rapport de un pour un. Obtenez la plate-forme de débit open source complète, y compris les pilotes de pression de gaz et les capteurs de débit. Incluez une lame de verre et des pointes de pipette chauffantes dans la configuration pour contrôler la température de l’échantillon de cellule d’agarose lorsqu’il pénètre dans la puce.

Ensuite, positionnez la puce microfluidique sur la platine de microscopie à stroboscope, en vous assurant que la jonction de génération de gouttelettes est visible. Réglez le réchauffeur de pointe de pipette et le réchauffeur de diapositive en verre à 40 °C à l’aide de l’interface du logiciel de contrôle. À l’aide d’une seringue munie d’un tube et d’un bouchon PDMS, chargez un mélange de suspension de cellules d’agarose à 1 % dans une pointe de pipette de 200 microlitres.

Insérez l’embout dans le réchauffeur d’embout et placez-le sur l’entrée de la phase aqueuse dans la puce microfluidique. Remplacez le joint PDMS de la pointe par celui connecté au tube du système de contrôle de débit. Ensuite, insérez le tube d’huile dans la deuxième entrée et l’extrémité du tube de sortie dans un tube de déchets.

Réglez ensuite la pression sur 80 millibars pour les phases d’acquiesce et d’huile sur l’interface utilisateur, et démarrez l’infusion de la suspension cellulaire et de l’huile. Ajustez la phase d’huile à 320 millibars et la phase d’acquiescement à 180 millibars. Prévoyez une minute pour stabiliser la génération de gouttelettes.

Une fois que la génération de gouttelettes s’est stabilisée, transférez le tube de sortie du tube de déchets au tube de collecte. Continuez à recueillir les gouttelettes sur la glace jusqu’à ce que le réservoir d’échantillon soit vide. Après la collecte, placez les tubes à quatre degrés Celsius pendant une heure pour laisser le gel d’agarose à l’intérieur des gouttelettes.

Incuber les microgouttelettes de gel contenant des bactéries et les gouttelettes de contrôle négatif à 37 degrés Celsius pendant quatre heures ou toute la nuit pour la croissance de la colonie. Après l’incubation, utilisez une seringue de trois millilitres avec une aiguille de calibre 21 pour retirer soigneusement autant d’huile que possible de la base de l’émulsion de microgouttelettes de gel. Transférez 50 microlitres de microgouttelettes de gel dans un nouveau microtube et stockez-le à quatre degrés Celsius pour une analyse plus approfondie des gouttelettes, ajoutez un mélange individuel d’huile fluorée avec du PFO dans un volume égal à l’émulsion restante.

Ensuite, ajoutez environ 200 microlitres de tampon de chlorure de sodium à 0,9 % sur l’émulsion. Vortex le mélange et faites-le tourner brièvement dans une centrifugeuse à vitesse fixe. Retirez soigneusement la phase huileuse du bas de l’interface liquide et jetez 100 microlitres de solution de chlorure de sodium par le haut.

Transférez deux microlitres de microgouttelettes de gel dans une lame de chambre d’imagerie et ajoutez cinq microlitres d’huile fluorée pour aider à former une monocouche de gouttelettes pour une imagerie optimale. Sur le microscope, activez l’éclairage matriciel LED blanc par le haut pour l’imagerie en fond clair. Montez la diapositive préparée.

Concentrez-vous sur l’échantillon pour localiser une monocouche de gouttelettes et capturer une image en fond clair. Ensuite, ajustez la roue à filtres pour qu’elle s’aligne avec le filtre de longueur d’onde verte. Passez à la LED de 470 nanomètres pour l’excitation et, sans déplacer l’échantillon, capturez une image fluorescente des colonies.

Transférez deux microlitres de microgels colorés à l’iodure de propidium dans une puce de chambre d’imagerie et ajoutez cinq microlitres de solution de chlorure de sodium à 0,9 % pour former une monocouche de microgels. Scellez l’entrée et la sortie de la puce pour éviter l’évaporation pendant l’imagerie. Ajustez le filtre d’intervalle de longueur d’onde rouge pour l’imagerie à l’iodure de propidium et capturez les images en fond clair et fluorescentes.

L’encapsulation cellulaire dans des microgouttelettes de gel a été confirmée par la microscopie à fond clair, qui montre des gouttelettes uniformes avec des cellules encapsulées distinctes. Les colonies qui ont perdu la fluorescence codée par plasmide ont été identifiées à l’aide de l’analyse du rapport de fluorescence. Sur 2 785 colonies analysées, 100 colonies ont perdu leur fluorescence, ce qui indique un taux de perte de plasmide de 3,6 %