Quantification de la charge bactérienne tissulaire dans un modèle murin d’infection intestinale chronique

Commencez par une souris euthanasiée infectée par une souche bactérienne résistante aux antibiotiques qui modélise une infection intestinale chronique.

Exposez la cavité abdominale pour accéder au cécum et à la rate.

Prélèvez les tissus cecals et spléniques, qui représentent les sites intestinaux et systémiques de colonisation bactérienne.

Placez chaque mouchoir dans un tube séparé contenant un tampon et une bille en acier.

Homogénéisez le tissu en agitant rapidement les tubes, ce qui provoque la collision des billes d’acier avec le tissu, la dégradation et la libération de bactéries dans la suspension.

Effectuer des dilutions en série des homogénéats dans le tampon afin de réduire la concentration bactérienne.

Les aliquotes de plaque de chaque dilution sur l’agar nutritif complétés par un antibiotique pour récupérer sélectivement les bactéries résistantes aux antibiotiques.

Incubez les plaques pour permettre aux bactéries viables de se développer en colonies.

Comptez les colonies pour estimer le nombre de bactéries viables par gramme de tissu et comparez les charges bactériennes dans le cécum et la rate.

D’abord, installez des microtubes à fond rond à verrouillage sécurisé de 2 millilitres, ajoutez 1 millilitre de PBS stérile et une bille en acier inoxydable autoclavé à chaque tube. Pesez les tubes avant la collecte des tissus.

Après l’euthanasie des souris, réséquez leurs tissus cécals et spléniques, en veillant à collecter les tissus des animaux individuels dans des tubes séparés. Pèser chaque tube pour déterminer le poids des tissus.

Utilisez un appareil de broyeur pour homogénéiser les tissus à 30 hertz pendant 15 minutes. Ensuite, transférez 900 microlitres de PBS dans chaque puits d’un méga-bloc de 2 millilitres à 96 puits. Pipeter 100 microlitres de tissu homogénéait dans le premier puits, et mélange bien.

Effectuer des dilutions en série en ajoutant 100 microlitres aux puits suivants, jusqu’à obtenir une dilution de 10 à la sixième dilution négative. La plaque 10 microlitres de chaque dilution triplique sur de l’agar LB contenant de la Streptomycine. Ensuite, comptez les unités moyennes de formation de colonies et déterminez les unités formatrices par gramme de tissu comme indiqué dans le protocole textuel.