Un protocole pour l'évaluation fonctionnelle de Whole-Protein Saturation mutagenèse Bibliothèques Utilisant à haut débit de séquençage

L’objectif général de ce protocole est de décrire l’évaluation fonctionnelle de banques complètes de protéines de mutagenèse par saturation sur un seul site, en utilisant le séquençage à haut débit. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biochimie et de l’évolution moléculaire. Par exemple, quelles sont les contraintes biochimiques, structurelles et évolutives sur les protéines ?

Et comment pouvons-nous concevoir des protéines avec de nouvelles fonctions ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle maximise un certain nombre de lectures de séquençage utiles dans une étude de mutagenèse de saturation en protéines entières, en multipliant la construction de banques et le séquençage. Après avoir préparé une plaque de PCR Master Mix selon le protocole du texte, utilisez une pipette multicanaux pour transférer 10 microlitres des plaques à 96 puits contenant les amorces de mutagénèse de détection préalablement diluées vers les puits apparentés dans les plaques de PCR.

Utilisez un joint de plaque pour couvrir chaque plaque de PCR et centrifugez à 200 G pendant deux minutes. Ensuite, transférez les plaques PCR dans un thermocycleur et exécutez le programme suivant. Après avoir effectué une PCR supplémentaire et dilué les réactions, de un à 100, transférez un microlitre des produits de PCR mutagène de première série mélangés et dilués, vers les puits apparentés des nouvelles plaques de PCR contenant Master Mix.

Utilisez un sceau de plaque pour couvrir chaque plaque PCR. Centrifugez les plaques à environ 200 G pendant deux minutes. Transférez ensuite les plaques dans le thermocycleur et exécutez le même programme que celui indiqué plus haut dans la vidéo.

Après avoir vérifié les tailles des produits PCR et mesuré les concentrations conformément au protocole textuel, mélangez 100 nanogrammes de chaque produit PCR de sous-bibliothèque NNS en cinq groupes de sous-banques NNS. Après avoir exécuté des réactions PCR de sous-bibliothèque et digéré des vecteurs de clonage dans les réactions PCR, conformément au protocole texte, configurez des réactions de ligature en suivant ces instructions pour chaque groupe de sous-bibliothèques NNS digéré, avec son vecteur de clonage digéré de restriction apparenté. Ensuite, incubez à température ambiante pendant une heure.

Une fois que les cellules E. coli électrocompétentes ont été décongelées, ajoutez dix microlitres de cellules à chaque réaction de ligature purifiée et transférez-les dans une cuvette d’électroprorata. Électroproratez les cellules à 1,8 kilovolts, puis ajoutez un millilitre de milieu SOB et incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, remettre en suspension 10 microlitres de chaque culture de récupération dans 990 microlitres de LB. Et étalez 100 microlitres sur des plaques de tarière LB contenant 12 microgrammes par millilitre de tétracycline.

Pour chaque culture de récupération, préparez une fiole de culture de 250 millilitres avec 50 millilitres de LB et 50 microlitres de tet-stock. Transférez environ un millilitre restant de culture de récupération dans une fiole. Incuber à 37 degrés Celsius et 200 tr/min pendant la nuit.

Après avoir compté le nombre de transformants réussis sur les plaques et isolé l’ADN plasmatique des cultures nocturnes, mélangez 100 nanogrammes de chaque plasmide. Après avoir transformé la banque d’ADN selon le protocole de texte, diluez la banque pendant la nuit à une OD-600 égale à 0,1. Et ajoutez un millilitre dans un flacon.

Incuber la culture de présélection à 37 degrés Celsius et 200 tr/min. Surveillez périodiquement la croissance en mesurant l’OD-600, jusqu’à ce qu’elle soit égale à 0,1. Transférez 100 millilitres de la culture de présélection dans deux tubes coniques de 50 millilitres et centrifugez à 4 000 G pendant six minutes, à quatre degrés Celsius.

Retirez la majeure partie du surnageant et combinez les granules en un seul tube conique de 15 millilitres. Ensuite, après avoir répété la centrifugation, retirez tout le surnageant. Dans les deux autres flacons, ajoutez de la tétracycline à une concentration finale de 12 microgrammes par millilitre.

Et un volume de la culture de présélection, de sorte que l’OD-600 final soit égal à 0,001. Dans un flacon, ajoutez un millilitre de 50 milligrammes par millilitre d’ampicilline à une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre. C’est la culture de la sélection.

Pendant l’incubation des cultures à 37 degrés Celsius à 200 RPM, surveillez la croissance de la culture ne contenant pas d’ampicilline jusqu’à ce qu’elle atteigne une OD-600 égale à 0,1. Mesurez également l’OD-600 de la culture de sélection. Après avoir divisé l’OD-600 de la culture de sélection en 0,1 et multiplié par 100, transférez ce volume dans des tubes coniques de 50 millilitres et centrifugez-le à 4 000 G et quatre degrés Celsius pendant six minutes.

Après avoir retiré la majeure partie du surnageant, combinez les granulés en un seul tube avant de tourner à nouveau et d’enlever tout le surnageant. Pour effectuer un séquençage à haut débit, préparez un Master Mix PCR et transférez 23 microlitres dans 10 tubes PCR. Ajoutez un microlitre de 0,5 nanogramme par microlitre d’ADN plasmidique purifié de la culture de présélection dans les tubes un à cinq.

Et de la culture de sélection aux tubes six à 10. Mélangez 50 microlitres d’amorces orthogonales directes de 50 micromolaires, OP1F à OP5F, avec les amorces orthogonales inverses respectives, OP1R à OP5R. Dans le même ordre, transférez un microlitre dans les tubes PCR un à cinq et six à 10.

Transférez les tubes PCR dans le thermocycleur et exécutez le programme suivant. Ensuite, diluez les réactions PCR 100 fois, en transférant un microlitre de chaque tube dans 99 microlitres d’eau. Mélangez bien, puis pipetez 99 microlitres des tubes et jetez-les.

Mélangez 50 microlitres d’amorces avant et inverses respectives. Ensuite, transférez un microlitre dans les tubes PCR un à cinq et six à 10. Ensuite, après avoir préparé un PCR Master Mix, ajoutez 23 microlitres dans chaque tube PCR et exécutez le programme suivant.

Pour effectuer les PCR finales pour ajouter des séquences d’indexation, après avoir dilué les réactions PCR 100 fois, comme précédemment, et en gardant un microlitre, ajoutez 23 microlitres du PCR Master Mix. Pour les tubes dont le gabarit provient des groupes de sous-bibliothèques NNS un à cinq, ajoutez 0,5 microlitre d’amorces avant 501F à 505F, respectivement. Pour les tubes avec gabarit issu de la présélection et des cultures de sélection, ajouter 0,5 microlitre d’amorces inversées 701R et 702R.

Exécutez le même programme de PCR que celui indiqué ci-dessus. Ensuite, après avoir mesuré les concentrations de chaque réaction selon le protocole textuel, mélangez 100 nanogrammes de chaque produit PCR dans un seul tube de micro-centrifugeuse. Après avoir ajouté un colorant de chargement de gel 6X, chargez l’ensemble de l’échantillon PCR combiné sur un gel d’agarose à deux pour cent.

Et faites fonctionner le gel à 100 volts, pendant 50 minutes. À l’aide d’un illuminateur UV de grande longueur d’onde, visualisez, puis excisez la tranche contenant le produit de PCR d’environ 360 paires de bases. Purifiez, séquencez et analysez l’échantillon conformément au protocole texte.

La carte plasmidique des cinq plasmides pBR322 modifiés contenant des sites d’amorçage orthogonaux est présentée ici. Les tests de spécificité des amorces orthogonales à l’aide de la PCR ont montré que le bon produit de PCR n’était obtenu que lorsque le plasmide correspondant était inclus dans la réaction. Et aucun produit de quelque taille que ce soit n’a été obtenu en son absence.

À la suite du traitement d’une expérience, 6,2 fois 10 à la sixième lecture de la condition de présélection et 6,3 fois 10 à la sixième lecture à partir de l’ampicilline ont été obtenues. Le nombre de mutations de chaque acide aminé à partir de la condition de présélection affiche une distribution log-normale. Cette figure représente l’effet de valeur adaptative relative, FIA, pour chaque mutation à chaque position de TEM-one.

Et sa distribution est montrée ici. Sous une sélection à 50 microgrammes par millilitre d’ampicilline, la plupart des mutations ont un effet de fitness neutre ou presque neutre. Correspondant aux pixels blancs ici, et au grand pic ici.

Une petite fraction des mutations à cette concentration d’antibiotiques a des effets substantiels sur la valeur adaptative. Comme prévu, il s’agit notamment de mutations au sein des résidus du site actif hautement conservés. En revanche, peu de pixels apparaissent comme significativement rouges.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une semaine environ. S’il est effectué correctement et que tous les réactifs sont disponibles. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de rester organisé pendant le clonage pour combiner les produits de PCR mutagènes dans les bons groupes et pour cloner dans les bons vecteurs.

Et lors de la préparation du séquençage, d’utiliser les bonnes amorces. Dans le prolongement de cette procédure, les principales étapes du protocole pourraient être modifiées pour examiner les combinaisons de mutations, les différents environnements de sélection et d’autres systèmes protéiques, afin de répondre à des questions supplémentaires concernant la dépendance des mutations au contexte génétique et environnemental. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension du travail nécessaire pour construire une banque de mutagénèse de saturation en protéines entières et pour évaluer les effets fonctionnels de chaque mutation simultanément, en utilisant le séquençage à haut débit.

N’oubliez pas que travailler avec du bromure d’éthidium et de la lumière ultraviolette peut être dangereux et que des précautions telles que des gants, une blouse de laboratoire et un écran UV doivent toujours être prises lors de l’exécution de certaines parties de ce protocole.