Name: Un protocole pour lévaluation fonctionnelle de Whole-Protein Saturation mutagenèse Bibliothèques Utilisant à haut débit de séquençage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Découvrez l'évaluation fonctionnelle de bibliothèques de mutagenèse par saturation complète de protéines par séquençage à haut débit. Cette méthode multiplexée maximise les lectures utiles pour étudier les contraintes biochimiques et évolutives des protéines.

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R.R. remercie les National Institutes of Health (RO1EY018720-05), la Fondation Robert A. Welch (I-1366) et le Green Center for Systems Biology.

<ol><li>Hutchison, C. A. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+at+a+specific+position+in+a+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence.</a> J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).</li>
<li>Mullis, K. B., Faloona, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+synthesis+of+DNA+in+vitro+via+a+polymerase-catalyzed+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction.</a> Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987).</li>
<li>Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+in+one+day+with+%3E80%25+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Strategies%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis in one day with >80% efficiency.</a> Strategies. 9 (3), 3-4 (1996).</li>
<li>Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+of+in+vitro+preparation+and+specific+mutagenesis+of+DNA+fragments%3A+study+of+protein+and+DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions.</a> Nucleic Acids Res. 16 (15), 7351-7367 (1988).</li>
<li>Rennell, D., Bouvier, S. E., Hardy, L. W., Poteete, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+mutation+of+bacteriophage+T4+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic mutation of bacteriophage T4 lysozyme.</a> J Mol Biol. 222 (1), 67-88 (1991).</li>
<li>Markiewicz, P., Kleina, L. G., Cruz, C., Ehret, S., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+studies+of+the+lac+repressor.+XIV.+Analysis+of+4000+altered+Escherichia+coli+lac+repressors+reveals+essential+and+non-essential+residues%2C+as+well+as+%27spacers%27+which+do+not+require+a+specific+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic studies of the lac repressor. XIV. Analysis of 4000 altered Escherichia coli lac repressors reveals essential and non-essential residues, as well as 'spacers' which do not require a specific sequence.</a> J Mol Biol. 240 (5), 421-433 (1994).</li>
<li>Kleina, L. G., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+studies+of+the+lac+repressor.+XIII.+Extensive+amino+acid+replacements+generated+by+the+use+of+natural+and+synthetic+nonsense+suppressors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic studies of the lac repressor. XIII. Extensive amino acid replacements generated by the use of natural and synthetic nonsense suppressors.</a> J Mol Biol. 212 (2), 295-318 (1990).</li>
<li>Huang, W., Petrosino, J., Hirsch, M., Shenkin, P. S., Palzkill, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+sequence+determinants+of+beta-lactamase+structure+and+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Amino acid sequence determinants of beta-lactamase structure and activity.</a> J Mol Biol. 258 (4), 688-703 (1996).</li>
<li>Fowler, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+of+protein+sequence-function+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping of protein sequence-function relationships.</a> Nat Methods. 7 (9), 741-746 (2010).</li>
<li>Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+illumination+of+a+fitness+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Experimental illumination of a fitness landscape.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (19), 7896-7901 (2011).</li>
<li>McLaughlin, R. N., Poelwijk, F. J., Raman, A., Gosal, W. S., Ranganathan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatial+architecture+of+protein+function+and+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The spatial architecture of protein function and adaptation.</a> Nature. 491 (7422), 138-142 (2012).</li>
<li>Deng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sequencing+of+systematic+combinatorial+libraries+reveals+beta-lactamase+sequence+constraints+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deep sequencing of systematic combinatorial libraries reveals beta-lactamase sequence constraints at high resolution.</a> J Mol Biol. 424 (3-4), 150-167 (2012).</li>
<li>Stiffler, M. A., Hekstra, D. R., Ranganathan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolvability+as+a+Function+of+Purifying+Selection+in+TEM-1+beta-Lactamase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evolvability as a Function of Purifying Selection in TEM-1 beta-Lactamase.</a> Cell. 160 (5), 882-892 (2015).</li>
<li>Matagne, A., Lamotte-Brasseur, J., Frere, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+properties+of+class+A+beta-lactamases%3A+efficiency+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Catalytic properties of class A beta-lactamases: efficiency and diversity.</a> Biochem J. 330 (Pt2), 581-598 (1998).</li>
<li>Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+evolution+of+TEM-1+beta-lactamase%3A+experimental+reconstruction+and+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Natural evolution of TEM-1 beta-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance.</a> FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).</li>
<li>Weinreich, D. M., Delaney, N. F., Depristo, M. A., Hartl, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Darwinian+evolution+can+follow+only+very+few+mutational+paths+to+fitter+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins.</a> Science. 312 (5770), 111-114 (2006).</li>
<li>Stewart, S. M., Fisher, M., Young, J. E., Lutz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ampicillin+levels+in+sputum%2C+serum%2C+and+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Ampicillin levels in sputum, serum, and saliva.</a> Thorax. 25 (3), 304-311 (1970).</li>
<li>Giachetto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ampicillin+and+penicillin+concentration+in+serum+and+pleural+fluid+of+hospitalized+children+with+community-acquired+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Infect+Dis+J%22%5BJournal%5D)">Ampicillin and penicillin concentration in serum and pleural fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia.</a> Pediatr Infect Dis J. 23 (7), 625-629 (2004).</li>
<li>Ambler, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standard+numbering+scheme+for+the+class+A+beta-lactamases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A standard numbering scheme for the class A beta-lactamases.</a> Biochem J. 276 (Pt 1), 269-270 (1991).</li>
<li>Magoc, T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH%3A+fast+length+adjustment+of+short+reads+to+improve+genome+assemblies%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies).</a> Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).</li>
<li>Melamed, D., Young, D. L., Gamble, C. E., Miller, C. R., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+mutational+scanning+of+an+RRM+domain+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+poly%28A%29-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Deep mutational scanning of an RRM domain of the Saccharomyces cerevisiae poly(A)-binding protein.</a> RNA. 19 (11), 1537-1551 (2013).</li>
<li>Bank, C., Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+survey+of+an+intragenic+epistatic+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">A systematic survey of an intragenic epistatic landscape.</a> Mol Biol Evol. 32 (1), 229-238 (2015).</li>
<li>Dove, S. L., Joung, J. K., Hochschild, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+prokaryotic+transcription+through+arbitrary+protein-protein+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of prokaryotic transcription through arbitrary protein-protein contacts.</a> Nature. 386 (6625), 627-630 (1997).</li>
<li>Romero, P. A., Tran, T. M., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+enzyme+function+with+microfluidic-based+deep+mutational+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dissecting enzyme function with microfluidic-based deep mutational scanning.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7159-7164 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents

Ici, un protocole est décrit pour effectuer l&#39;évaluation fonctionnelle des bibliothèques de mutagenèse à saturation de protéine entière, en utilisant la technologie de séquençage à haut débit. Un aspect important du procédé est l&#39;utilisation d&#39;amorces orthogonales au cours du processus de clonage. En bref, chaque position d&#39;acide aminé est aléatoire par PCR mutagène et mélangés ensemble dans des groupes de positions dont la longueur séquence combinée est reçue par séquençage à haut débit. Ces groupes son...

Mutagenèse a longtemps été employé dans le laboratoire pour étudier les propriétés des systèmes biologiques et de leur évolution, et pour produire des protéines ou des organismes mutants avec des fonctions améliorées ou nouvelles. Alors que les premières approches comptaient sur ​​les méthodes qui produisent des mutations aléatoires dans les organismes, l&#39;avènement de la technologie de l&#39; ADN recombinant a permis aux chercheurs d&#39;introduire certains changements à l&#39; ADN d&#39;une manière spécifique au site, ie., La mutagenèse dirigée 1,2. Avec les techniques actuelles, typiquement en utilisant des oligonucléotides mutagènes dans une réaction en chaîne par polymérase (PCR), il est relativement facile de créer et d&#39; évaluer de petits nombres de mutations (par ex., Mutations ponctuelles) dans un gène donné 3,4. Il est beaucoup plus difficile mais quand les approches de but, par exemple, la création et l&#39;évaluation de tous à un seul site possible (ou d&#39;ordre supérieur) mutations. Alors que beaucoup a été appris par les premières études qui tentent d&#39;évaluer un grand nombre de mutations dans les gènes, les techniques utilisées étaient souvent laborieux, nécessitant par exemple l&#39;évaluation de chaque mutation en utilisant indépendamment un non - sens suppresseur souches 5-7, ou ont été limités dans leur capacité quantitative en raison de la faible profondeur de Sanger séquençage 8 de séquençage. Les techniques utilisées dans ces études ont été largement supplanté par des procédés utilisant à haut débit la technologie de séquençage 9-12. Ces approches conceptuellement simples impliquent la création d&#39; une bibliothèque comprenant un grand nombre de mutations, en soumettant la bibliothèque à un écran ou à la sélection pour la fonction, puis profonde séquençage (ie., De l&#39;ordre de&gt; 10 6 séquençage lit) la bibliothèque obtenue avant et après la sélection. De cette manière, les effets phénotypiques ou en forme d&#39;un grand nombre de mutations représentées par la variation de fréquence de population de chaque mutant, peut être évalué simultanément, et de manière plus quantitative. Nous avons déjà mis en place un simp(. -à- dire, protéine entière bibliothèques saturation de mutagenèse) approche le pour évaluer les bibliothèques de tous les possibles mutations d&#39;acides aminés simples dans les protéines, applicable à des gènes d&#39;une longueur plus longue que le séquençage lu longueur 11,13: Tout d&#39; abord, chaque position d&#39;acide aminé est randomisée par site dirigé PCR mutagène. Pendant ce processus, le gène est divisé en groupes composés de positions contiguës d&#39;une longueur totale reçue par la plateforme de séquençage. Les produits de PCR mutagenes pour chaque groupe sont ensuite combinées et soumises à chaque groupe indépendamment de la sélection et le séquençage à haut débit. En maintenant une correspondance entre la localisation des mutations dans la séquence et la longueur séquençage de lecture, cette approche présente l&#39;avantage de maximiser la profondeur de séquençage: alors que l&#39; on pourrait tout simplement la séquence de ces bibliothèques dans les fenêtres courtes sans se diviser en groupes (par exemple, par un fusil standard. approche de séquençage), la plupart se lit obtenu serait de type sauvage et donc la majorité de séquençage débit gaspillé (par exemple, pour une bibliothèque mutagenèse à saturation protéine entière d&#39;une protéine d&#39;acide 500 aminé séquencé dans 100 acides aminés (300 pb) de fenêtres, au minimum 80% de lit sera la séquence de type sauvage). Ici, un protocole est présenté qui utilise le séquençage à haut débit pour l&#39;évaluation fonctionnelle des bibliothèques saturation mutagenèse-protéine entière, en utilisant l&#39;approche ci - dessus (présenté sur la figure 1). Surtout, nous introduisons l&#39;utilisation d&#39;amorces orthogonales dans le processus de clonage bibliothèque à code-barres de chaque groupe de séquences, ce qui leur permet d&#39;être multiplexés dans une bibliothèque, soumis simultanément à un dépistage ou à la sélection, puis démultiplexé pour le séquençage en profondeur. Etant donné que les groupes de séquences ne sont pas soumises à une sélection de façon indépendante, ce qui réduit la charge de travail et veille à ce que chaque mutation subit le même niveau de sélection. TEM-1 β-lactamase, une enzyme qui confère une résistance de haut niveau pourles antibiotiques β-lactames (par ex., à l&#39; ampicilline) dans des bactéries est utilisé comme système modèle 14-16. Un protocole est décrit pour l&#39;évaluation d&#39;une saturation de banque de mutagenèse, la protéine entière TEM-1 dans E. coli sous sélection à un niveau sérique approximatif d&#39;une dose clinique de l&#39; ampicilline (50 pg / ml) 17,18.

<table><tbody><tr><td>Typtone</td><td>Research Products Intl. Corp.</td><td>T60060-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Research Products Intl. Corp.</td><td>Y20020-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de potassium Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate</td><td>de magnésium Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de tétracycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660-5G</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de Pétri</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB&nbsp ;</td><td>Mathworks</td><td>http://www.mathworks.com/products/matlab/</td><td></td></tr> <tr><td>Amorces oligonucléotidiques</td><td>Technologies d’ADN intégrées</td><td>https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos</td><td>échelle de 25 nmol, pBR322_AvrII de dessalage standard</td></tr><tr><td></td><td>disponible sur demande</td><td></td><td>Plasmide pBR322 modifié pour contenir le site de restriction AvrII en aval du gène TEM-1</td></tr><tr><td>pBR322_OP1 &ndash ; pBR322_OP5</td><td>disponible sur demande</td><td></td><td>cinq plasmides pBR322 modifiés, contenant chacun une paire de sites d’amorçage orthogonaux</td></tr><tr><td>: ADN polymérase haute fidélité Q5</td>, <td>New England Biolabs</td><td>M0491L</td><td>: comprend 5 tampons PCR et additif PCR (GC enhancer)</td></tr><tr><td>Tube conique de 15 ml</td><td>Corning</td><td>430025</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes multicanaux (Eppendorf, ResearchPlus)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaque PCR, 96 puits</td><td>Fisher Scientific</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>96 puits</td><td>Joint de plaque Excel Scientific</td><td>F-96-100</td><td></td></tr><tr><td>Veriti Thermocycleur à 96 puits</td><td>Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>6x gel loading colorant</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Research Products Intl. Corp.</td><td>20090-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0433</td><td></td></tr><tr><td>Transilluminateur UV (FOTO/Analyst ImageTech)</td><td>Fotodyne Inc.</td><td></td><td></td>http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation</tr><tr><td>tampon EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Plaques d’essai à 96 puits à paroi noire et à fond transparent</td><td>Corning</td><td>3651</td><td></td></tr><tr><td>Lambda phage DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3011S</td><td></td></tr><tr><td>PicoGreen réactif d’ADNdb</td><td>Invitrogen</td><td>P7581</td><td>réactif de quantification de l’ADNdb, utilisé à l’étape 2.2.4 du protocole</td></tr><tr><td>Victor Lecteur de microplaques 3 V</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de purification d’ADN</td><td>Zymo Research</td><td>D4003</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger</td><td>Corning</td><td>3621</td><td></td></tr><tr><td>Illuminateur UV à longue longueur d’onde</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBUVLS-80</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’extraction d’ADN en gel d’agarose</td><td>Zymo Research</td><td>D4001-1-100</td><td></td></tr><tr><td>AatII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0117S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>EVB100 électrocompétent E. coli</td><td>Avidity</td><td>EVB100</td><td></td></tr><tr><td>Électroporateur (E. coli Pulser)</td><td>Bio-Rad</td><td>1652102</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes d’électroporation</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2089</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre (Ultrospec 3100 pro)</td><td>Amersham Biosciences</td><td>80211237</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubes coniques</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purification de plasmides</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740588.25</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de bandelettes PCR 8 puits</td><td>Axygen</td><td>321-10-551</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS kit de dosage</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>dsDNA réactif de quantification</td></tr><tr><td>Tubes de dosage</td><td>Qubit Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimètre Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline sel sodique</td><td>Akron Biotechnology</td><td>50824296</td><td></td></tr><tr><td>Kit de réactifs MiSeq v2 (500 cycles)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>Séquenceur de bureau MiSeq</td><td>Illumina</td><td>http://www.illumina.com/systems/miseq.html</td><td>alternativement, on pourrait séquencer sur la plate-forme Illumina HiSeq</td></tr><tr><td>le logiciel FLASh</td><td>John Hopkins University - open source</td><td>http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/</td> <td>logiciel pour fusionner les lectures d’extrémités appariées à partir de données de séquençage de nouvelle génération</td></tr><tr><td>AatII_F</td><td></td><td></td><td>GATAATAATGGTTTCTTAGACG TCAGGTGGC</td></tr><tr><td>AvrII_R</td><td></td><td></td><td>CTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT TAAAAATGAAG</td></tr><tr><td>AvrII_F</td><td></td><td></td><td>CTTCATTTTTAATTTAAAAGGA CCTAGGTGAAG</td></tr><tr><td>AatII_OP1_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCCGTATTTCAAC 
TGTCCGGTCTAAGAAACCATT 
ATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP2_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCCGCTCACGGA 
GTGTACTAATTAAGAAACCATT 
ATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP3_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCGTACGTCTGA 
ACTTGGGACTTAAGAAACCA 
TTATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP4_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCCCGTTCTCGAT 
ACCAAGTGATAAGAAACCATT 
ATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP5_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCGTCCGTCGGA 
GTAACAATCTTAAGAAACCAT 
TATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>OP1_F</td><td></td><td></td><td>GACCGGACAGTTGAAATACG</td></tr><tr><td>OP1_R</td><td></td><td></td><td>CGACGTACAGGACAATTTCC</td></tr><tr><td>OP2_F</td><td></td><td></td><td>ATTAGTACACTCCGTGAGCG</td></tr><tr><td>OP2_R</td><td></td><td></td><td>AGTATTAGGCGTCAAGGTCC</td></tr><tr><td>OP3_F</td><td></td><td></td><td>AGTCCCAAGTTCAGACGTAC</td></tr><tr><td>OP3_R</td><td></td><td></td><td>GAAAAGTCCCAATGAGTGCC</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> OP4_F <td>TCACTTGGTATCGAGAACGG</td></tr><tr><td>OP4_R</td><td></td><td></td><td>TATCACGGAAGGACTCAACG</td></tr><tr><td>OP5_F</td><td></td><td></td><td>AGATTGTTACTCCGACGGAC</td></tr><tr><td>OP5_R</td><td></td><td></td><td>TATAACAGGCTGCTGAGACC</td></tr><tr><td>Group1_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNGC 
ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC</td></tr><tr><td>Group1_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC 
TTGCCCGGCGTCAAC</td></tr><tr><td>Group2_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNGA 
ACGTTTTCCAATGATGAGCAC</td></tr><tr><td>Group2_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT 
CCTCCGATCGTTGTCAGAAG</td></tr><tr><td>Group3_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNAG 
TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC</td></tr><tr><td>Group3_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC 
GCCAGTTAATAGTTTGCGC</td></tr><tr><td>Group4_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNCC 
AAACGACGAGCGTGACAC</td></tr><tr><td>Group4_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGC 
AATGATACCGCGAGACCC</td></tr><tr><td>Group5_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNNCG 
GCTGGCTGGTTTATTGC</td></tr><tr><td>Group5_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT 
ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG</td></tr><tr><td>501_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCGA 
GATCTACACTATAGCCTACAC 
TCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>502_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCGA 
GATCTACACATAGAGGCACA 
CTCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>503_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA 
GATCTACACCCTATCCTACAC 
TCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>504_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA 
GATCTACACGGCTCTGAACA 
CTCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>505_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCGA 
GATCTACACAGGCGAAGACA 
CTCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>701_R</td><td></td><td></td><td>CAAGCAGACGGCATAC 
GAGATCGAGTAATGTGACTG 
GAGTTCAGACGTG</td></tr><tr><td>702_R</td><td></td><td></td><td>CAAGCAGACGGCATAC 
GAGATTCTCCGGAGTGACTG 
GAGTTCAGACGTG</td></tr></tbody></table>

un protocole pour l&#39;évaluation fonctionnelle de whole-protein saturation mutagenèse bibliothèques utilisant à haut débit de séquençage

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

La mutagenèse dirigée a longtemps été utilisée comme méthode pour interroger la structure, la fonction et l’évolution des protéines. Les progrès récents de la technologie de séquençage massivement parallèle ont ouvert la possibilité d’évaluer les effets fonctionnels ou de fitness d’un grand nombre de mutations simultanément. Ici, nous présentons un protocole pour déterminer expérimentalement les effets de toutes les mutations possibles d’un seul acide aminé dans une protéine d’intérêt en utilisant la technologie de séquençage à haut débit, en utilisant l’enzyme de résistance aux antibiotiques à 263 acides aminés TEM-1 β-lactamase comme exemple. Dans cette approche, une banque de mutagénèse par saturation en protéines entières est construite par PCR mutagène dirigée sur site, randomisant chaque position individuellement pour tous les acides aminés possibles. La banque est ensuite transformée en bactéries et sélectionnée pour sa capacité à conférer une résistance aux antibiotiques β-lactamines. L’effet de fitness de chaque mutation est ensuite déterminé par un séquençage profond de la banque avant et après la sélection. Il est important de noter que ce protocole introduit des méthodes qui maximisent la profondeur de lecture du séquençage et permettent la sélection simultanée de l’ensemble de la bibliothèque de mutations, en mélangeant des positions adjacentes en groupes de longueur de longueur de séquençage à haut débit et en utilisant des amorces orthogonales pour coder chaque groupe à barres. Des résultats représentatifs obtenus à l’aide de ce protocole sont obtenus en évaluant les effets sur la valeur adaptative de toutes les mutations d’un seul acide aminé dans TEM-1 à une dose cliniquement pertinente d’ampicilline. La méthode doit pouvoir être facilement étendue à d’autres protéines pour lesquelles un test de sélection à haut débit est en place.

La carte de plasmide pour les cinq plasmides pBR322 modifié contenant des sites d&#39;amorçage orthogonales (pBR322_OP1 - pBR322_OP5) est représentée sur la figure 2A. Pour tester si les amorces sont spécifiques orthogonales, PCR ont été réalisées en utilisant des amorces de chaque paire individuellement orthogonaux, ainsi que l&#39;ensemble des cinq plasmides pBR322_OP1-5 ou avec tous les plasmides moins le plasmide correspondant à la paire d&#39;amorces orthogonale. Le...

Nous présentons un protocole pour l&#39;évaluation fonctionnelle des bibliothèques saturation site unique mutagenèse complets de protéines en utilisant le séquençage à haut débit. Fait important, cette approche utilise des paires d&#39;amorces orthogonales pour multiplexer la construction et le séquençage bibliothèque. Les résultats représentatifs en utilisant TEM-1 β-lactamase sélectionnée à une dose cliniquement pertinente de l&#39;ampicilline sont fournis.

Un protocole pour l&#39;évaluation fonctionnelle de Whole-Protein Saturation mutagenèse Bibliothèques Utilisant à haut débit de séquençage

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

L’objectif général de ce protocole est de décrire l’évaluation fonctionnelle de banques complètes de protéines de mutagenèse par saturation sur un seul site, en utilisant le séquençage à haut débit. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biochimie et de l’évolution moléculaire. Par exemple, quelles sont les contraintes biochimiques, structurelles et évolutives sur les protéines ?Et comment pouvons-nous concevoir des protéines avec de nouvelles fonctions ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle maximise un certain nombre de lectures de séquençage utiles dans une étude de mutagenèse de saturation en protéines entières, en multipliant la construction de banques et le séquençage. Après avoir préparé une plaque de PCR Master Mix selon le protocole du texte, utilisez une pipette multicanaux pour transférer 10 microlitres des plaques à 96 puits contenant les amorces de mutagénèse de détection préalablement diluées vers les puits apparentés dans les plaques de PCR.Utilisez un joint de plaque pour couvrir chaque plaque de PCR et centrifugez à 200 G pendant deux minutes. Ensuite, transférez les plaques PCR dans un thermocycleur et exécu

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Détecter des altérations génétiques somatiques dans des échantillons de tumeurs par Exon et le séquençage massivement parallèle

En utilisant des puces à protéines contenant presque toute la S. cerevisiae protéome est sondé pour interrogatoire impartiale rapide de milliers d'interactions protéine-protéine en parallèle. Cette méthode peut être utilisée pour la molécule de protéine-petite, la modification post-traductionnelle, et d'autres dosages in à haut débit.

Sondage haute densité fonctionnels des puces à protéines pour détecter les interactions protéine-protéine

Les modèles de protéinopathie de levure sont des outils précieux pour évaluer la toxicité et l’agrégation des protéines impliquées dans la maladie. Nous présentons ici des méthodes de criblage des banques de variants de Hsp104 pour les suppresseurs de toxicité. Ce protocole pourrait être adapté pour dépister n’importe quelle bibliothèque de protéines à la recherche de suppresseurs de toxicité de toute protéine toxique chez la levure.

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Ce manuscrit décrit les protocoles cliniques de deux panels de séquençage de nouvelle génération. Un panel interroge les tumeurs malignes hématologiques tandis que l’autre panel cible les gènes couramment mutés dans les tumeurs solides. La classification moléculaire des mutations motrices dans les tumeurs malignes humaines offre des informations pronostiques et prédictives précieuses.

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La résistance aux médicaments à thérapies ciblées est très répandue et la nécessité d'identifier les mécanismes de résistance - avant ou après l'apparition des symptômes - est essentiel pour guider les stratégies alternatives de gestion clinique. Ici, nous présentons un protocole de coupler dérivation de lignées résistantes aux médicaments in vitro avec le séquençage d'accélérer la découverte de ces mécanismes.

Implémentation de<em&gt; In Vitro</em&gt; Résistance au médicament Essais: Maximiser le potentiel pour découvrir cliniquement importants mécanismes de résistance

Les protéines qui se lient à des séquences d’ARN spécifiques jouent un rôle crucial dans l’expression des gènes. Une caractérisation détaillée de ces sites de liaison est cruciale pour notre compréhension de la régulation des gènes. Ici, une approche pas à pas pour la mutagénèse de saturation des sites de liaison protéique dans l’ARN est décrite. Cette approche est pertinente pour tous les sites de liaison aux protéines dans l’ARN.

Une approche de mutagenèse roman Saturation : Seule étape caractérisation des protéines régulatrices accepteurs en ARN utilisant Phosphorothioates

Ce protocole présente une méthode pour évaluer l’activité protéolytique d’une protéase intrinsèquement peu fréquentés, seul chiffre d’affaires dans un contexte cellulaire. Plus précisément, cette méthode est appliquée pour évaluer l’activité protéolytique de PCSK9, un facteur clé du métabolisme lipidique, dont l’activité protéolytique est requise pour sa fonction ultime hypercholestérolémique.

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Cet article décrit une méthode pour identifier des altérations clonales et subclonales parmi différents spécimens d'un patient donné. Bien que les expériences décrites ici se concentrent sur un type spécifique de tumeur, l'approche est largement applicable à d'autres tumeurs pleines.

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Les personnes atteintes de mutations BRCA1 ont un risque plus élevé de développer un cancer, ce qui justifie une évaluation précise de la fonction des variantes BRCA1. Ci-après, nous avons décrit un protocole pour l’évaluation fonctionnelle des variantes BRCA1 à l’aide d’éditeurs de base de cytosine à base crispr- médiatisés qui permettent la conversion ciblée de C:G à T:A dans les cellules vivantes.

Évaluation fonctionnelle des variantes BRCA1 à l’aide d’éditeurs de base à base de CRISPR

Découvrez l'évaluation fonctionnelle de bibliothèques de mutagenèse par saturation complète de protéines par séquençage à haut débit. Cette méthode multiplexée maximise les lectures utiles pour étudier les contraintes biochimiques et évolutives des protéines.

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