Name: La cartographie des réseaux fonctionnels bactériens et voies de Escherichia Coli En utilisant des tableaux synthétiques génétiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: Apprenez à cartographier les réseaux fonctionnels bactériens et les voies métaboliques d'Escherichia coli en utilisant la technologie eSGA. Cette méthode permet d'identifier les interactions génétiques et d'analyser la fitness des souches.

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Ce travail a été soutenu par des fonds de Génome Canada, l&#39;Ontario Genomics Institute, et les Instituts de recherche en santé subventions à JG et AE AG est récipiendaire de bourses d&#39;études supérieures du Canada Vanier.

<ol><li>Bandyopadhyay, S., Kelley, R., Krogan, N. J., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maps+of+protein+complexes+from+quantitative+genetic+interaction+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional maps of protein complexes from quantitative genetic interaction data.</a> PLoS Comput. Biol. 4, e1000065(2008).</li>
<li>Costanzo, M., Baryshnikova, A., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+the+genetic+interaction+map+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Charting the genetic interaction map of a cell.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 66-74 (2011).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-4231 (2010).</li>
<li>Fiedler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+S.+cerevisiae+phosphorylation+network%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the S. cerevisiae phosphorylation network.</a> Cell. 136, 952-963 (2009).</li>
<li>Roguev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+rewiring+of+functional+modules+revealed+by+an+epistasis+map+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conservation and rewiring of functional modules revealed by an epistasis map in fission yeast.</a> Science. 322, 405-4010 (2008).</li>
<li>Schuldiner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+function+and+organization+of+the+yeast+early+secretory+pathway+through+an+epistatic+miniarray+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Wilmes, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+interaction+map+of+RNA-processing+factors+reveals+links+between+Sem1%2FDss1-containing+complexes+and+mRNA+export+and+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic interaction map of RNA-processing factors reveals links between Sem1/Dss1-containing complexes and mRNA export and splicing.</a> Mol. Cell. 32, 735-746 (2008).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-level+approaches+for+identifying+and+analyzing+genetic+interaction+networks+in+Escherichia+coli+and+extensions+to+other+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Systems-level approaches for identifying and analyzing genetic interaction networks in Escherichia coli and extensions to other prokaryotes.</a> Mol. Biosyst. 12, 1439-1455 (2009).</li>
<li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((coli+synthetic+genetic+array+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">coli synthetic genetic array analysis.</a> Nat. Methods. 5, 789-7895 (2008).</li>
<li>Typas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+peptidoglycan+synthesis+by+outer-membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of peptidoglycan synthesis by outer-membrane proteins.</a> Cell. 143, 1097-10109 (2010).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, 2006-200008 (2006).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interaction+maps+in+Escherichia+coli+reveal+functional+crosstalk+among+cell+envelope+biogenesis+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic interaction maps in Escherichia coli reveal functional crosstalk among cell envelope biogenesis pathways.</a> PLoS Genet. 7, e1002377(2011).</li>
<li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+landscape+of+a+bacterial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phenotypic landscape of a bacterial cell.</a> Cell. 144, 143-156 (2011).</li>
<li>Babu, M., Gagarinova, A., Greenblatt, J., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array-based+synthetic+genetic+screens+to+map+bacterial+pathways+and+functional+networks+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Array-based synthetic genetic screens to map bacterial pathways and functional networks in Escherichia coli.</a> Methods Mol Biol. 765, 125-153 (2011).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-665 (2000).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+recombination+system+for+chromosome+engineering+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).</li>
<li>Typas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((quantitative+analyses+of+genetic+interactions+in%5BTitle%5D)+AND+%22E.+coli.+Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">quantitative analyses of genetic interactions in.</a> E. coli. Nat. Methods. 5, 781-787 (2008).</li>
<li>Zeghouf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Peptide+Affinity+%28SPA%29+system+for+the+identification+of+mammalian+and+bacterial+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes.</a> J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).</li>
<li>Davierwala, A. P., et al. , 1147-1152 (2005).</li>
<li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat. Methods. 5, 711-718 (2008).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+peptide+affinity+purification+system+for+the+systematic+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli.</a> Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).</li>
<li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+network+containing+conserved+and+essential+protein+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli.</a> Nature. 433, 531-537 (2005).</li>
<li>Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+functional+atlas+of+Escherichia+coli+encompassing+previously+uncharacterized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins.</a> PLoS Biol. 7, (2009).</li>
<li>Anderson, R. P., Roth, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+genetic+duplications+in+phage+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tandem genetic duplications in phage and bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 31, 473-505 (1977).</li>
<li>Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+genetic+interactions+and+networks+with+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Exploring genetic interactions and networks with yeast.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 437-449 (2007).</li>
<li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissection+of+protein+complexes+involved+in+yeast+chromosome+biology+using+a+genetic+interaction+map%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map.</a> Nature. 446, 806-8010 (2007).</li>
<li>Le Meur, N., Gentleman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+synthetic+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Modeling synthetic lethality.</a> Genome Biol. 9, R135(2008).</li>
<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+mapping+of+the+yeast+genetic+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global mapping of the yeast genetic interaction network.</a> Science. 303, 808-813 (2004).</li>
<li>Wong, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+biological+networks+to+predict+genetic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Combining biological networks to predict genetic interactions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15682-15687 (2004).</li>
<li>van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn-seq%3A+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nat. Methods. 6, 767-772 (2009).</li>
<li>Gagarinova, A., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+genetic+manipulation+methods+for+exploring+bacterial+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Genome-scale genetic manipulation methods for exploring bacterial molecular biology.</a> Mol. Biosyst. 8, 1626-1638 (2012).</li>
<li>Dewey, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+orthology%3A+putting+genomic+evolutionary+relationships+into+context%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Positional orthology: putting genomic evolutionary relationships into context.</a> Brief Bioinform. 12, 401-412 (2011).</li>
<li>St Onge, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+pathway+analysis+using+high-resolution+fitness+profiling+of+combinatorial+gene+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Systematic pathway analysis using high-resolution fitness profiling of combinatorial gene deletions.</a> Nat. Genet. 39, 199-206 (2007).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous avons établi un protocole étape par étape pour l&#39;utilisation de robotique de dépistage ESGA pour enquêter sur les fonctions des gènes bactériens à un niveau voie en interrogeant GI. Cette approche peut être utilisée pour étudier les gènes individuels ainsi que les systèmes biologiques entières dans E. coli. Attentivement l&#39;exécution des étapes expérimentales décrites ci-dessus, y compris tous les contrôles appropriés, et rigoureusement l&#39;analyse et la validation des données indépendamment GI so...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;I. Antibiotiques&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Chloramphénicol</td><td>Bioshop</td><td>#CLR201</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td></td><td>#KAN201</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td></td><td># AMP201</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2. Milieu Luria-Bertani&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>poudre de LB</td><td>Bioshop</td><td>#LBL405</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bioshop</td><td>#AGR003</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;3. Souches bactériennes et plasmides&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>souche Hfr Cavalli &amp;#955;&lt;sub&gt;rouge&lt;/sub&gt; système (JL238)</td><td>Babu &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKD3</td><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; Centre de ressources génétiques, Yale</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keio &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; collection de souches réceptrices F-</td><td>Projet national des ressources biologiques (NBRP) du Japon&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypomorphe &lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;Souches F- marquées SPA</td><td>Open biosystems ; Babu &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;4. Amorces&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Amorces constantes désalées basées sur pKD3</td><td></td><td></td><td>F1 : 5′-GGCTGACATGGGAATTAGC-3′&#039;&lt;br/&gt; R1 : 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3'</td></tr><tr><td>Amorces personnalisées désalinisées</td><td></td><td></td><td>Cm-R : 5′-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3′&#039;&lt;br/&gt; Cm-F : 5′- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3′</td></tr><tr><td>Amorces personnalisées désalinisées</td><td></td><td></td><td>F2 et R2 : régions constantes de 20 nucléotides basées sur la séquence de pKD3 et régions d'homologie personnalisées de 45 nucléotides&lt;br/&gt; Région constante F2 :&lt;br/&gt; 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3&#039;&lt;br/&gt; Région constante R2 :&lt;br/&gt; 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3' S1 et S2 : régions constantes de 27 nucléotides permettant l'amorçage de l'amplification de la cassette SPA-Cm et régions d'homologie personnalisées de 45 nucléotides&lt;br/&gt; Région constante S1 :&lt;br/&gt; 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3'&#039;&lt;br/&gt; région constante S2 :&lt;br/&gt; 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3'&#039;&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; KOCO-F et KOCO-C : amorces de 20 nt situées à 200 pb du site de délétion du gène non essentiel ou du gène essentiel&lt;br/&gt; site d'insertion de la marque SPA pour le gène</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;5. Réactifs pour la PCR et l'électrophorèse&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Taq polymérase ADN</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>tampon PCR 10X</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10 mM de dNTPs</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>25 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td># AGA002</td><td></td></tr><tr><td>Colorant de charge</td><td>NEB</td><td>#B7021S</td><td></td></tr><tr><td>Bromure d'éthidium</td><td>Bioshop</td><td># ETB444</td><td></td></tr><tr><td>Tampon TBE 10X</td><td>Bioshop</td><td># ETB444.10</td><td></td></tr><tr><td>Base de Tris</td><td>Bioshop</td><td># TRS001</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Sigma</td><td># T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8,0)</td><td>Sigma</td><td># B6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>échelle d'ADN</td><td>NEB</td><td>#N3232L</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;6. Kits d'isolement et de purification de l'ADN&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Kit d'isolement et de purification de l'ADN génomique</td><td>Promega</td><td>#A1120</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Midi kit</td><td>Qiagen</td><td># 12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>#28104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;7. Équipement pour la PCR, la transformation et le piquage par réplique&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cycliseur thermique</td><td>BioRad, iCycler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Électrophorèse sur gel d'agarose</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Électroporateur</td><td>Bio-Rad GenePulser II</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cuvette d'électroporation de 0,2 cm</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>42 &amp;deg;bain-marie agitateur à eau</td><td>Innova 3100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Beckman Coulter TJ-25</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &amp;deg;C shaker</td><td>New Brunswick Scientific, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &amp;deg;incubateur de plaques C</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Robot de paillasse RoToR-HDA</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaques à embouts de densités 96, 384 et 1 536</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 ou 384 broches longues</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;8. Équipements d'imagerie&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Support pour caméra</td><td>Kaiser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Appareil photo numérique, 10 mégapixels</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boîtes lumineuses, Testrite 16&quot; x 24&quot; unités</td><td>Testrite</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;9. Recyclage des barrettes ou des plaques &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>10 % d'eau de Javel</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>éthanol à 70 %</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eau distillée stérile</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hotte à flux laminaire</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lampe ultraviolette</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;10. Matériel de laboratoire&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Tubes en polypropylène de 50 ml</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes micro-centrifuge de 1,5 ml</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fioles coniques de 250 ml</td><td>VWR</td><td># 29140-045</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de culture stériles de 15 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td># 366052</td><td></td></tr><tr><td>Vials cryogéniques</td><td>VWR</td><td># 479-3221</td><td></td></tr><tr><td>Plaques rectangulaires</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaques microtitrations 96 puits et 384 puits</td><td>Singer Instruments</td><td>Nunc</td><td></td></tr><tr><td>Rouleau pour sceller les plaques multi-puits</td><td>Sigma</td><td>#R1275</td><td></td></tr><tr><td>plaque</td><td>ABgene</td><td># AB-0580</td><td></td></tr><tr><td>Scellés adhésifs pour plaques</td><td>Fisher Scientific</td><td># 13-990-14</td><td></td></tr><tr><td>-80 &amp;deg;congélateur C</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la cartographie des réseaux fonctionnels bactériens et voies de<em&gt; escherichia coli</em&gt; en utilisant des tableaux synthétiques génétiques

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phénotypes sont déterminés par une série complexe de physique (par exemple protéine-protéine) et fonctionnelle (p. ex gène-gène ou génétique) des interactions (GI) 1. Alors que les interactions physiques peuvent indiquer quelles protéines bactériennes sont associées sous forme de complexes, ils ne révèlent pas nécessairement la voie au niveau relationships1 fonctionnels. Écrans GI, dans lequel la croissance des doubles mutants porteurs de deux gènes délétés ou inactivés est mesurée et comparée aux simples mutants correspondants, peut éclairer les dépendances entre les loci épistatiques et donc de fournir un moyen pour interroger et découvrir de nouveaux liens fonctionnels 2. Cartes à grande échelle GI ont été rapportés pour les organismes eucaryotes comme les levures 3-7, mais les informations restent rares IG pour les procaryotes 8, ce qui entrave l&#39;annotation fonctionnelle des génomes bactériens. À cette fin, nous et d&#39;autres avons développé à haut débit quantitatives bactériennes méthodes de dépistage GI 9, 10 </sup&gt;. Nous présentons ici les principales étapes requises pour effectuer quantitative E. coli synthétique procédure de dépistage génétique Array (ESGA) sur une échelle du génome 9, en utilisant la conjugaison bactérienne naturelle et la recombinaison homologue pour générer et systémique pour évaluer la justesse d&#39;un grand nombre de doubles mutants dans un format de tableau colonie. bref, un robot est utilisé pour transférer , grâce à la conjugaison, le chloramphénicol (Cm) - a marqué allèles mutants de Hfr ingénierie (haute fréquence de recombinaison) «souches donateurs dans un ensemble ordonné de kanamycine (Kan) - marqués F-bénéficiaires souches. Typiquement, nous utilisons la perte de fonction simples mutants portant des délétions de gènes non essentiels (par exemple, la collection «Keio &#39;11) et des mutations de gènes essentiels hypomorphes (allèles conférant à savoir l&#39;expression des protéines réduite, la stabilité ou l&#39;activité 9, 12, 13) interroger les associations fonctionnelles de gènes non essentiels et indispensables, respectivement. Après conjugaison et qui a suivi l&#39;échange génétique induite par recombinaison homologue, les mutants résultants doubles sont sélectionnés sur milieu solide contenant deux antibiotiques. Après conséquence, les plaques sont numériquement imagée et la taille des colonies sont quantitativement classé par un système interne automatisé de traitement d&#39;image 14. Les IG sont révélés lorsque le taux de croissance d&#39;un double mutant est soit significativement meilleure ou pire que 9 attendu. Aggravante (ou négative) des IG entraînent souvent entre la perte de fonction des mutations dans les gènes de paires de voies compensatoires qui empiètent sur ​​le même processus essentiel 2. Ici, la perte d&#39;un seul gène est tamponnée, de sorte que soit seul mutant est viable. Cependant, la perte des deux voies est délétère et les résultats de létalité synthétique ou de maladie (c.-à croissance lente). A l&#39;inverse, apaisantes (ou positif) des interactions entre les gènes peuvent se produire dans la même voie ou de protéines complexes 2 commedélétion de gène supporte seul est souvent suffisante pour perturber le fonctionnement normal de la voie ou complexes tels que des perturbations supplémentaires ne réduisent pas l&#39;activité, et donc la croissance, en outre. Dans l&#39;ensemble, l&#39;identification systématique et l&#39;analyse des réseaux IG peut fournir sans parti pris, des cartes mondiales des relations fonctionnelles entre un grand nombre de gènes, d&#39;où la voie au niveau de l&#39;information manquée par d&#39;autres approches peuvent être inférées 9.

Les interactions génétiques (IG) révèlent des relations fonctionnelles entre les gènes. De même, puisque les gènes appartenant au même chemin métabolique présentent des profils d'IG similaires, et que la similarité des profils d'IG reflète la congruence des phénotypes, il est possible de regrouper les gènes fonctionnellement associés en voies métaboliques en regroupant leurs profils d'IG. L'intégration des réseaux d'IG et de corrélation d'IG avec des données d'interactions physiques ou d'autres associations, telles que l...

Systématiques et à grande échelle de synthèse génétiques écrans d&#39;interaction gène-gène (ou épistasie) peut être utilisé pour explorer la redondance génétique et la voie de la diaphonie. Ici, nous décrivons un haut débit quantitatif synthétique de la technologie génétique de dépistage tableau, appelé ESGA que nous avons développé pour élucider les relations épistatiques et l&#39;exploration des réseaux d&#39;interactions génétiques<em&gt; Escherichia coli</em&gt;.

La cartographie des réseaux fonctionnels bactériens et voies de<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; En utilisant des tableaux synthétiques génétiques

Les phénotypes sont déterminés par une série complexe d'interactions physiques (par ex. protéine-protéine) et fonctionnelles (par ex. gène-gène ou génétiques) (GI)1. Alors que...

L'objectif de cette procédure est d'étudier les relations fonctionnelles entre les gènes et les voies bactériennes. Cela est réalisé en premier lieu par la préparation d'une série de souches uniques de mutants d'Escherichia coli, qui seront ensuite soumises à une conjugaison ou un croisement. La deuxième étape consiste à effectuer la conjugaison des mutants uniques selon un format matriciel sur des boîtes de culture.Ensuite, les doubles mutants sont sélectionnés. La dernière étape consiste à imager les boîtes des doubles mutants et à quantifier les colonies de doubles mutants afin de déterminer la capacité adaptative des souches. En définitive, les données de taille des colonies sont analysées pour calculer les scores d'interaction génétique et identifier les gènes, voies et processus fonctionnellement interagissant.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la mutagenèse aléatoire réside dans la possibilité de créer de nombreuses souches doubles mutantes individuelles. De plus, les interactions entre de nombreux gènes peuvent être évaluées simultanément, indépendamment de la taille du gène, de son caractère essentiel ou de la capacité d

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La cartographie des réseaux fonctionnels bactériens et voies de Escherichia Coli En utilisant des tableaux synthétiques génétiques (Vidéo) | JoVE Journal

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