La cartographie des réseaux fonctionnels bactériens et voies de Escherichia Coli En utilisant des tableaux synthétiques génétiques

L’objectif de cette procédure est d’étudier les relations fonctionnelles entre les gènes et les voies bactériennes. Ceci est accompli en préparant d’abord un réseau de ceia coli, des souches mutantes uniques qui seront conjuguées ou accouplées. La deuxième étape consiste à conjuguer les mutants simples dans un format de tableau sur des plaques.

Ensuite, les doubles mutants sont sélectionnés. La dernière étape consiste à imager les plaques doubles mutantes et à quantifier les colonies doubles mutantes pour déterminer la valeur adaptative de la souche. En fin de compte, les données sur la taille de la colonie sont analysées pour calculer les scores d’interaction génétique et identifier les gènes, les voies et les processus qui interagissent fonctionnellement.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la mutagénèse aléatoire, est que de nombreuses souches doubles mutantes individuelles peuvent être créées. De plus, les interactions entre de nombreux gènes peuvent être évaluées simultanément, indépendamment de la taille du gène, de l’essentialité ou de l’aptitude mutante d’un seul gène. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des systèmes, telles que celles relatives aux fonctions des gènes et à la diaphonie fonctionnelle entre les voies et les processus.

Les implications de cette technique s’étendent au traitement des infections bactériennes, car la connaissance de la plupart des gènes et processus centraux fonctionnels, ainsi que la compréhension des combinaisons de gènes, de voies et de processus bactériens lorsqu’ils sont perturbés améliorent ou réduisent la valeur adaptative bactérienne aideront à développer les stratégies d’intervention les plus efficaces pour commencer ce protocole. Imbriqué en deux étapes. L’amplification par PCR est utilisée pour remplacer le cadre de lecture ouvert cible par un marqueur de résistance au chloramphénicol du plasmide PKD trois, comme décrit dans la procédure écrite.

Confirmer le produit attendu et la PCR purifier le fragment obtenu en suivant le protocole du fabricant. Après avoir élué le produit PCR dans 30 microlitres d’eau distillée stérile, diluer à une concentration d’environ 50 milligrammes par microlitre. Le produit purifié est stocké à moins 20 degrés Celsius avant d’être transformé.

Ensuite, préparez les cellules compétentes à haute fréquence de recombinaison ou HFR Caval pour la construction du donneur. Inoculez d’abord un millilitre d’une culture de nuit saturée de la souche HFR Cavalli dans 70 millilitres de milieu LB frais avec 35 microlitres de 50 milligrammes par millilitre. Ampicilline dans une fiole de 250 millilitres.

Incuber la culture à 32 degrés Celsius en agitant doucement à 220 tr/min jusqu’à l’obtention d’une densité optique d’environ 0,5 à 0,6. Transférez ensuite la culture dans un bain-marie pour l’induction thermique du système de recombinaison Lambda Red à 42 degrés Celsius pendant 15 minutes avec agitation à 160 RPM pour arrêter l’induction. Transférez la culture dans un bain-marie de boue de glace réfrigérée pendant 10 à 20 minutes à 160 tr/min.

Assurez-vous de garder les cellules froides jusqu’après la transformation. Après avoir lavé et récolté les cellules par centrifugation comme décrit dans le protocole écrit, décantez le séné et remettez en suspension le granulé dans 500 microlitres de glace froide, 10 % de glycérol Eloqua. Les cellules d’un volume de 50 microlitres sont transformées en tubes microcentri individuels pré-refroidis de 1,5 millilitre et passent immédiatement à la transformation.

Ajouter 100 nanogrammes de délétion de gène purifiée, cassette aux cellules compétentes. Actionnez le tube et laissez la suspension reposer sur la glace pendant cinq minutes. Transférez ensuite la suspension dans un électroporation pré-refroidi vete electro, faites fonctionner le mélange de cellules immédiatement.

Ajoutez un millilitre de milieu SOC à température ambiante et transférez les cellules électroporées dans le milieu dans un tube de culture de 15 millilitres. Incuber les cellules à 32 degrés Celsius pendant une heure avec une secousse orbitale à 220 tr/min. Après l’incubation, centrifugez les cellules de 4 400 fois G pendant cinq minutes.

À température ambiante, retirez environ 850 microlitres de supinate et remettez en suspension la pastille cellulaire dans le liquide restant. Répartissez les cellules sur des plaques LB contenant 17 microgrammes par millilitre, chloramphénicol et incubez à 32 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, deux transformants individuels sont sortis sur des plaques de chloramphénicol LB pour la confirmation des mutants, des traînées ont été produites avec les mêmes transformants sur des plaques de mycine LB pour confirmer que les souches ne sont pas résistantes à la mycine.

Ensuite, l’ADN est amplifié avec trois ensembles différents d’amorces de confirmation knock-out, comme décrit dans le protocole écrit. Le premier ensemble d’amorces se compose d’une amorce avant flanquante de 20 nucléotides située à 200 paires de bases en amont de la région ciblée, et d’une amorce inverse, qui est complémentaire à la cassette de résistance au chloramphénicol. Cette amplification devrait produire un amplicon de 445 nucléotides.

La deuxième série comprend une amorce directe, un agenouillement sur la séquence de la cassette de résistance au chloramphénicol et une amorce de confirmation flanquante inversée, qui est conçue pour former 200 paires de bases en aval des trois extrémités premières du gène supprimé. Cette réaction d’amplification devrait produire un amplicon de 309 nucléotides. La troisième PCR contient à la fois des amorces flanquantes en amont et en aval.

Cette réaction est nécessaire pour confirmer que la souche sélectionnée n’est pas une souche diploïde de la moelle avec un locus de gène ayant été remplacé par la cassette et un autre dupliqué, mais une copie de gène de type sauvage toujours présente. Cette amplification devrait produire un produit de 1,4 Ko. La collection de mutants de délétion de gène non essentiel unique e coli ke io est répliquée robotiquement à 24 384.

Eh bien, microplaque contenant 80 microlitres de milieu liquide LB par puits. Complété par 50 microgrammes par millilitre, la mycine peut faire de la place pour la souche de contrôle frontalier, qui manquait en tant que contrôle positif et aidait à la normalisation des plaques ainsi qu’à la quantification automatisée des colonies. Retirez le milieu inoculé des puits les plus externes de chaque plaque et transférez-le sur de nouvelles plaques, en laissant les puits les plus extérieurs vides.

De même, créez des points de contrôle négatifs en retirant deux souches d’un endroit différent dans chaque plaque et en transférant les souches sur une nouvelle plaque. Ensuite, remplissez les puits vides, y compris les puits de contrôle aux frontières et les puits de contrôle négatif, avec un média LV contenant 17 microgrammes par millilitre de chloramphénicol. On s’attend à ce que ces points de contrôle négatifs soient vides chez le receveur et donc à double plaque mutante.

Ils servent à s’assurer qu’il n’y a pas eu d’erreurs de traitement ou de manipulation des plaques lors de la numérotation, de l’imagerie ou de l’épinglage des plaques. Après avoir préparé la souche positive de bordure comme décrit dans la procédure écrite, les souches de la puce ainsi que la souche positive de la bordure sont cultivées pendant la nuit à 32 degrés Celsius avec une secousse orbitale de 190 tr/min le lendemain, remplissent les puits de bordure avec environ 80 microlitres de la culture de nuit. Les plaques assemblées peuvent être utilisées pour l’accouplement comme décrit dans la section suivante.

Alternativement, pour un stockage à long terme, chaque puits dans les plaques réceptrices est complété par 15 % de glycérol et le milieu et le glycérol sont mélangés. Les plaques sont ensuite stockées à moins 80 degrés Celsius. Commencez la procédure d’accouplement en cultivant la souche donneuse HFR, portant la délétion du gène de requête marquée avec une cassette de résistance au chloramphénicol pendant une nuit à 32 degrés Celsius dans un milieu liquide LB riche avec 17 microgrammes par millilitre de broche de chloramphénicol.

Le TH a ordonné la collecte de mutants récepteurs en 3 84 densités de colonies sur des plaques LB solides. Complété par 50 microgrammes par millilitre de mycine en conserve. En parallèle, épinglez la souche mutante de requête donneuse dans une densité de colonie de 3 84 sur le même nombre de plaques LB.

Complété par 17 microgrammes par millilitre de chloramphénicol. Incuber les plaques pendant la nuit à 32 degrés Celsius pour conjuguer les souches. Épinglez le donneur des 3 84 plaques donneuses de nuit de la colonie sur des plaques LB solides.

Ensuite, épinglez les souches d’une seule plaque receveuse de 3 84 colonies pendant la nuit sur les donneurs fraîchement épinglés. Incuber les plaques de conjugaison épinglées à 32 degrés Celsius pendant 16 à 24 heures. Ensuite, épinglez chaque plaque de conjugaison de densité 384 sur une seule plaque LB solide contenant du chloramphénicol.

Et la mycine peut-elle répéter ce processus jusqu’à ce que toutes les plaques de conjugaison aient été épinglées ? Incuber les premières assiettes de sélection fraîchement épinglées pendant 16 à 36 heures à 32 degrés Celsius. Après l’incubation, réépinglez chaque première plaque de sélection sur une deuxième plaque de sélection de médicament double en format SPOT 1536 afin que chaque première colonie de sélection soit représentée par quatre colonies.

Sur la deuxième plaque de sélection, incubez les plaques pendant 16 à 36 heures. À 32 degrés, photographiez les plaques finales de sélection des doubles mutants pour mesurer quantitativement la valeur adaptative à la croissance des mutants et pour analyser les interactions entre les paires de gènes. Étant donné que les gènes d’une même voie présentent des modèles gastro-intestinaux étroitement corrélés, les gènes fonctionnellement liés peuvent être regroupés en les regroupant en fonction de la similitude globale de leurs profils de score S.

La similitude du profil gastro-intestinal représente la congruence des phénotypes lors de la mutation de deux gènes et devrait indiquer si les deux gènes agissent dans la même voie ou dans une voie qui se chevauche. La distribution des coefficients de corrélation entre les profils GI des paires de gènes codant pour des protéines en interaction physique par rapport à des paires de gènes tirées au hasard est illustrée ici. Un exemple de nuage de points de profils génétiques corrélés pour deux transporteurs qui forment un complexe hétérotrimérique nécessaire à l’excrétion des spermatozoïdes est montré comme avec l’apparition du gène ecoline de levure.

Les interactions atténuantes avec des profils gastro-intestinaux fortement corrélés ont tendance à coder des voies qui sont physiquement associées ou qui agissent de manière cohérente dans une voie biochimique commune. Ici, un exemple représentatif est montré où les composants des voies de biosynthèse du soufre de fer ISC et SUF fonctionnellement redondantes, qui participent conjointement à un processus essentiel, forment des grappes distinctes qui sont liées entre elles par des interactions aggravantes étendues. Une mesure statistique peut être utilisée pour trouver tout enrichissement significatif des interactions entre des combinaisons spécifiques de voies, l’intégration des réseaux GI avec des interactions physiques et d’autres données d’association fonctionnelle, telles que le contexte génomique.

Les relations peuvent révéler l’organisation de modules fonctionnels d’ordre supérieur qui définissent les systèmes biologiques de base chez les bactéries. L’analyse de grappes peut également être appliquée aux réseaux GI pour prédire les fonctions des gènes annotés. Étant donné que les algorithmes de clustering varient.

Cependant, les affectations fonctionnelles présumées déterminées par regroupement nécessitent une vérification expérimentale indépendante. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’inclure tous les positifs et négatifs nécessaires à la suite de cette procédure. D’autres méthodes telles que la protéomique, les expériences de suivi biochimique et la génomique chimique peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires sur des fonctions géniques spécifiques ainsi que sur la nature des relations fonctionnelles entre les gènes et les voies.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de construire des souches doubles mutantes, d’assembler des réseaux de receveurs et d’effectuer des criblages ESGA pour étudier les relations fonctionnelles entre les gènes et les processus chez e coli.