Méthode d'insertion de levure Colony

L’objectif global de cette procédure est d’intégrer des colonies de levures. Pour ce faire, il suffit d’abord de retirer une colonie et la gélose sous-jacente d’une plaque de gélose, de la placer sur plusieurs gouttes de gélose fondue et de la recouvrir rapidement de plus d’aer fondu. Ensuite, l’excès d’AER est coupé de la colonie pour la rendre suffisamment petite pour tenir dans un moule.

La colonie enfouie dans l’AER est ensuite fixée, colorée, déshydratée et enfin infiltrée avec de la résine d’éperons Le bloc est ensuite placé dans un moule avec des éperons supplémentaires de résine incubés jusqu’à durcissement puis sectionnés. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent la distribution des types de cellules au sein d’une colonie de levures par microscopie optique ou électronique.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la microscopie électronique à balayage, est qu’elle permet de déterminer la structure interne de la colonie. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement microbien, telles que la distribution des types de cellules au sein des colonies. Cette méthode a permis de mieux comprendre la structure des colonies de CAC de croce, mais il est probable qu’elle puisse également être appliquée à d’autres micro-organismes.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la manipulation et l’intégration des colonies peuvent être difficiles à apprendre à partir d’un protocole écrit. L’idée de cette méthode a été inspirée par des données génétiques que nous avons publiées en 2002 et qui suggéraient que les spores n’étaient pas uniformément réparties dans les colonies. Nous avons adapté une méthode de coupe des colonies qui a été développée par Engelberg dans le laboratoire des nageoires.

Alors commençons. Commencez par incuber la levure Wild S visi sur des plaques de tarière à 30 degrés jusqu’à ce qu’environ 300 colonies soient présentes. À l’aide d’une spatule étroite, retirez les colonies d’un à deux millimètres de diamètre, une à la fois, de la plaque.

Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre, placez plusieurs gouttes de gélose à 2 % à 42 degrés Celsius sur une lame de microscope, et placez immédiatement la colonie sur la gélose face vers le haut avant que l’AER ne se solidifie. Placez plusieurs gouttes supplémentaires de gélose sur la colonie et laissez la gélose se solidifier en vous assurant que toute la colonie, y compris le haut de la colonie, est enfermée dans de la gélose. Dans toutes les étapes de protocole ultérieures avec une lame de rasoir.

Coupez l’AER autour de la colonie et placez le bloc AER contenant la colonie. Dans un flacon à bouchon à vis en bo silicate de 3,5 millilitres contenant 2 % d’aldéhyde paraforme et 2 % de glutaraldéhyde, les colonies fixatrices doivent être traitées, une à la fois pour éviter le dessèchement, mais jusqu’à 10 colonies peuvent être placées dans le même flacon. Laissez les colonies pendant sept jours à quatre degrés Celsius.

Après une semaine, retirez le fixateur et lavez les colonies agricoles deux fois, en utilisant environ 1,5 millilitre de sodium à 0,15 molaire. Dégustez à pH 7,2 et incubez sur de la glace après chaque lavage pendant 15 minutes sans agitation. Après ce lavage deux fois de plus.

À l’aide de 1,5 millilitre d’un tampon X OS, composé de 100 millimolaires de phosphate monopotassique, de 10 millimolaires de chlorure de magnésium à pH 6,0, en incubant sur de la glace pendant cinq minutes après chaque lavage. Ensuite, à l’aide du même flacon, effectuez le traitement à l’osmium et les lavages énumérés ici et dans la partie écrite de ce protocole. Là encore, à l’aide du même flacon, effectuez les déshydratations par étapes énumérées ici et dans le protocole écrit qui l’accompagne tôt le lendemain matin.

Préparez le réactif des éperons comme indiqué ici et dans le protocole écrit qui l’accompagne. Lavez immédiatement les blocs agricoles cinq fois pendant 10 minutes, chacune avec 1,5 millilitre d’éthanol à 100 % à température ambiante. Après le dernier lavage à l’éthanol, retirez juste assez d’éthanol pour que le bloc agricole reste couvert.

À l’aide d’une pipette de pâturage, placez environ 0,5 millilitre de réactif d’éperons dans le flacon et tournez-le sur une roue à basse vitesse pendant 15 minutes. À température ambiante après rotation, laissez reposer le flacon pendant 30 minutes. Ensuite, retirez complètement la solution.

Ajoutez ensuite 1,5 millilitres de réactif d’éperons pour couvrir le bloc agricole. Encore une fois, faites tourner le flacon sur une roue pendant 15 minutes à température ambiante et laissez reposer pendant 30 minutes. Répétez ce lavage.

Faites trois pas de plus. Après les 30 dernières minutes, retirez le réactif d’éperons et ajoutez du réactif d’éperons frais pour couvrir les blocs. Laissez les blocs agricoles reposer à température ambiante pendant quatre heures.

Remplacez le réactif des éperons et tournez pendant la nuit. Le lendemain matin, remplacez le réactif des éperons et laissez les flacons tourner jusqu’au lendemain. Le lendemain matin, placez le réactif des éperons dans des moules en silicone numérotés pour couvrir juste le fond des moules.

Placez ensuite les blocs agricoles dans les moules et incubez à 60 degrés Celsius pendant quatre heures. Après quatre heures, complétez les moules avec plus d’éperons, de réactif et incubez à 60 degrés Celsius pendant la nuit. Retirez les blocs du moule pour le sectionnement.

Un exemple de micrographie optique d’une coupe passant par le centre d’une colonie de levure Wild S Visia est montré ici. Cette levure est une souche de type sauvage isolée à partir d’exsudats d’arbres. La colonie a été incubée pendant six jours sur un milieu YNA avant la section.

Sur cette image, on distingue facilement les levures asai, pseudo hyphy et ovoïdes et la région de la colonie envahissant la gélose sous-jacente est également apparente. Les flèches ouvertes indiquent les flèches représentatives remplies d’asai, les pointes de flèche indiquent les cellules végétatives ovoïdes représentatives, indiquent les chaînes de cellules allongées et si. Cette image est un exemple de micrographie électronique d’une coupe mince d’une souche de levure de laboratoire SH 1 0 2 0 et W 3 0 3.Contexte.

La colonie a été incubée pendant six jours sur un milieu YNA avant la section. L’image montre une région de la colonie contenant une fréquence élevée de cellules sporulées. Une flèche indique la structure bicouche de la paroi des spores.

Dans la partie A, nous montrons une section d’une colonie de quatre jours avec une grille composée de 15 rectangles superposés à l’image de la partie B.La fréquence des cellules liées aux spores dans chaque rectangle est greffée avec les 15 barres correspondant aux 15 rectangles montrés dans la partie A.Les données sont la moyenne et l’erreur-type de quatre colonies indépendantes de quatre jours Dans la partie C, Les moyennes et les erreurs-types pour quatre colonies indépendantes de huit jours sont indiquées. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux semaines avec une journée complète et plusieurs journées d’une à trois heures. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’ajouter les solutions immédiatement afin que les blocs ne se dessèchent pas Suite à cette procédure.

D’autres méthodes, comme l’immunomicroscopie électronique, pourraient éventuellement être utilisées pour déterminer la distribution des cellules qui expriment des protéines particulières après son développement. Cette technique nous a permis d’examiner non seulement la structuration des cellules sporulées, mais aussi la structuration des cellules pseudo-hyphes dans les colonies de croce CCI. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’intégrer des colonies de levures pour la section.

N’oubliez pas que de nombreux réactifs de microscopie utilisés dans ce protocole peuvent être extrêmement dangereux. N’oubliez pas d’utiliser une hotte, de porter des vêtements de protection et d’éliminer correctement les réactifs. D’accord, c’est tout.

Merci d’avoir regardé. Bonne chance dans vos expériences.