Name: Enrobage de paraffine et de profilés minces des colonies microbiennes Biofilms pour analyse microscopique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Apprenez l'enrobage de paraffine et le profilage mince des biofilms microbiens pour analyser l'expression génique et la morphologie native. Cette technique permet une imagerie haute résolution des communautés bactériennes.

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Ce travail a été soutenu par la NSF carrière prix 1553023 et NIH/NIAID prix R01AI103369.

1. la croissance de Pseudomonas aeruginosa colonie Biofilms
<ol><li>Préparation des plaques de Medium-bicouche<ol>
<li>Préparer un tryptone 10 g/L, la gélose de 10 g/L (voir Table des matières) de solution dans l’eau désionisée.</li>
		<li>Autoclave pendant 20 min. laisser refroidir à 50-60 ° C dans un bain d’eau.</li>
		<li>Versez 45 mL de la solution de Gélose tryptone dans un plat carré de 100 x 100 mm (voir Table des matières) à l’aide d’un tube conique de 50 mL. Permettre l’agar pour solidifier (~ 20-30 min). Verser une deuxième couche 15 mL au sommet de la première couche. Laisser solidifier du jour au lendemain, enlever la condensation de couvercles si nécessaire en l’essuyant avec un chiffon non pelucheux.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repérer les Biofilms de colonie<ol>
<li>Ensemencer les souches d’intérêt provenant des stocks du congélateur sur LB agar plaques13 et incuber dans l’obscurité pendant 12 à 16 h à 37 ° C et 80-100 % d’humidité relative.</li>
		<li>Pour chaque souche ou reproduire, utiliser une seule colonie pour ensemencer 2 mL de LB et incuber dans l’obscurité pendant 12-16 h à 37 ° C sous agitation à 250 tr/min.</li>
		<li>Sub culture par dilution au 1/100 en frais LB et en laissant incuber dans l’obscurité pendant 2,5 à 3 h à 37 ° C sous agitation à 250 tr/min.</li>
		<li>Mesurer la densité optique à l’aide d’un spectrophotomètre et ajuster avec LB stérile pour obtenir une suspension de cellules avec une OD500 nm de ~ 0,5.</li>
		<li>Selon la colonie désirée taille, ajouter 2,5-10 µL de la suspension de cellules sur une plaque de médium-bicouche (préparée à l’étape 1.1) et permettent la tache sécher pour environ 20 min. laisser le couvercle petri ajar près d’une flamme peut faciliter le séchage.</li>
		<li>Incuber le spots colonies à 25 ° C et 80-100 % d’humidité relative, dans l’obscurité pendant 4 jours.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. préparation de la Solution de fixation
<ol><li>Préparer la solution de fixation sur le jour de la récolte d’échantillon. Diluer les 37 % de formaldéhyde (FA) dans du PBS 1 x à une concentration finale de 4 % FA. ATTENTION : FA est volatile et toxique. Porter un équipement protecteur et travailler sous une hotte ventilée.</li>
	<li>Immédiatement avant l’utilisation, dissoudre le chlorhydrate de L-lysine dans 4 % FA (préparé à l’étape 2.1) à température ambiante pour une concentration finale de 50 mM de L-lysine HCl.</li>
</ol>3. Application du fixateur à la colonie de Biofilm [facultatif] directe
NOTE : Nous avons trouvé que le biofilm morphologie est mieux conservée lors de la superposition d’agar est ajoutée avant la fixation. Toutefois, cette étape constitue également un changement dans les conditions environnementales qui pourraient influer sur l’expression des gènes. Modèles d’expression de journaliste fluorescent devraient donc être vérifiées en utilisant un protocole distinct dans lequel l’étape de la fixation est effectuée avant l’ajout de la superposition d’agar, comme décrit ici.
<ol><li>Le jour de la fixation et de travailler sous une hotte ventilée, pipette le fixatif préparé à l’étape 2 directement sur la surface de la gélose autour de la colonie, lui permettant d’atteindre la périphérie de la colonie sans submergeant. Ne s’appliquent que comme beaucoup le fixateur qu’est nécessaire pour pleinement entourent la colonie, environ 500 µL. permettre le fixateur de diffuser dans la colonie et l’agar environnante.</li>
	<li>Une fois que le fixateur a été complètement absorbé dans la colonie et les médias environnants, environ 20-30 min, et FA résiduelle n’est plus visible sur la plaque, répétez l’étape 3.1. Laissez ce fixatif de diffuser dans la colonie et l’agar environnante.</li>
	<li>Une fois que le fixateur est entièrement absorbé par la colonie et les environs media Répétez l’étape 3.1, ce moment appliquer fixateur sur la surface de la colonie directement. Permettre ce fixatif de diffuser dans la colonie et l’agar environnante, procéder à l’étape 4 seulement après tout fixateur a été absorbée et n’est plus visible sur la plaque.</li>
</ol>4. recouvrement des Colonies avec Agar
<ol><li>Le jour de la fixation, préparer un 10 g/L de solution d’agar dans l’eau désionisée et stériliser pendant 10-20 minutes pour dissoudre. Laisser refroidir dans un bain d’eau à 50 ° c.</li>
	<li>Verser doucement 15 mL de la solution d’agar sur le milieu de croissance et de la colonie. Permettre l’agar pour former un gel à température ambiante pendant 5 min (Figure 1 b).</li>
	<li>Utiliser une lame de rasoir tranchante pour couper un mandrin carré, 3 couches avec la colonie laminée entre les couches supérieures de deux. Si vous préparez plusieurs échantillons, veiller à ce que chaque découpe est de taille comparable.</li>
	<li>Délicatement enlever excès agar du mandrin contenant de colonie.</li>
	<li>Pour soulever les deux couches supérieures de la gélose (contenant la colonie) loin de la couche de fond du mandrin (Figure 1), mouiller la tête plate d’une spatule en 1 x PBS ou eau et insérez délicatement entre les couches supérieures et inférieures. La colonie feuilletée devrait séparer de la couche inférieure. Veillez à ne pas déformer ou plier la colonie feuilletée en soulevant de sa base.</li>
</ol>5. fixation
<ol><li>Travailler sous une hotte ventilée, transférer immédiatement la colonie feuilletée (c.-à-d., 2 couches chuck) dans une cassette d’encastrement (voir Table des matières), marquées avec un stylo de marquage résistant aux produits chimiques. Placez la cassette d’encastrement dans une enveloppe de lame de verre (voir table des matières) contenant le fixatif préparé en étapes 2.1-2.2. Assurez-vous qu’il n’y a aucune bulle d’air emprisonné à l’intérieur de la cassette d’encastrement.</li>
	<li>Incuber l’échantillon dans le fixateur pendant la nuit dans l’obscurité à température ambiante.</li>
</ol>6. traitement : Tampon de lavage, la déshydratation, compensation et Infiltration
<ol><li>Après fixation au jour le jour, laver l’échantillon deux fois dans du PBS 1 x 1 h chaque. Pour de meilleurs résultats, automatiser l’homogénéisation de réactif à l’aide de la vrille fonction d’un processeur de tissu automatique (voir table des matières) réglée sur un réglage bas. Si aucun processeur n’est disponible, le traitement peut être exécuté manuellement.</li>
	<li>Suivez le tampon de lavage par déshydratation à travers une série graduée de solutions dans l’éthanol (EtOH) dans du PBS 1 x (25 %, 50 %, 70 %, 95 %) pendant 1 h à température ambiante chaque.</li>
	<li>Déshydrater en trois lavages de 100 % EtOH pour chacune 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Désactivez l’échantillon déshydraté en trois lavages d’agent de compensation de base d’huile orange 100 % (voir tableau des matériaux) pour 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Infiltrez l’échantillon dégagé deux fois avec de la paraffine fondue de cire (voir Table des matières), chauffé à 55 ° c, pendant 2 heures chacun.</li>
</ol>7. échantillon incorporation
<ol><li>Remplissez un moule en cire de paraffine liquide chauffé à 55 ° c. Utilisez une spatule plate, chauffée permet de transférer rapidement le mandrin infiltré de la cassette d’encastrement dans le moule de cire, en veillant à ce que le mandrin est parallèle à la base du moule. Ne pas appliquer une pression excessive sur le mandrin. Moules de cire peuvent être personnalisé 3D imprimée, ou sont disponibles dans le commerce (voir Table des matières).</li>
	<li>Laisser la cire se solidifier durant la nuit à 4 ° c. Moulé dans la cire solide des échantillons peuvent être conservés indéfiniment à 4 ° c.</li>
	<li>Une fois la cire a solidifié, l’échantillon du moule de l’accise et couper l’excès de cire d’autour de l’échantillon avec une lame de rasoir. Laissez les excès de cire qui s’étend d’un bout de l’échantillon, parallèle au plan de coupe, qui peut servir à fixer dans le microtome (voir Table des matières). Également laisser une gaine de cire, d’environ 1 mm d’épaisseur, autour de l’échantillon et lisser ses faces.</li>
</ol>8. découpe
<ol><li>Faire chauffer un bain d’eau à 42 ° c. Serrer l’échantillon dans le microtome à la surface de la colonie orientée perpendiculairement au bord de la lame (voir Table des matières).</li>
	<li>Couper l’échantillon à des intervalles de 50 µm jusqu'à ce que le plan désiré de la colonie a été atteint, d'où sections seront recueillies.</li>
	<li>Couper un ruban le nombre désiré de coupes 10 µm d’épaisseur à l’aide d’un microtome, affectez une sectionnement vitesse de 75 à 80 tr/min et un angle de dégagement de 6-10 °. Utilisez un pinceau à pointe fine pour détacher le ruban de la lame.</li>
	<li>À l’aide d’une goutte d’eau à l’extrémité d’une pipette Pasteur (de préférence) ou une pince, transférer doucement le ruban à l’eau du bain. Veillez à éviter les bulles d’air de piégeage en vertu de la section.</li>
	<li>Immédiatement, insérer une diapositive dans le bain-marie et positionnez-le sous le ruban à un angle de 45˚.</li>
	<li>Appuyer sur le côté étroit du ruban pour la diapositive, juste en dessous de l’étiquette givré. Le ruban doit respecter.</li>
	<li>Tirer la lame sortant du bain d’eau, réglage de l’angle de devenir perpendiculaire à la surface de l’eau et en permettant le ruban à plat contre la lame sur toute sa longueur. Ne pas emprisonner l’eau en excès sous le ruban.</li>
	<li>Doucement, se tiennent le glisser sur un tissu absorbant pelucheux, évacuant l’excès d’eau dans la section.</li>
	<li>Poser la culasse sur du papier absorbant et laissez-les sécher à température ambiante pendant la nuit dans l’obscurité. Diapositives peuvent être conservés indéfiniment à 4 ° c dans l’obscurité.</li>
</ol>9. fixation des chaleur, réhydratation et montage
<ol><li>Faire chauffer une plaque chauffante nivelée à 45 ° c. Faire chauffer la lame pendant 30-60 min. La cire deviendra semi fondue et aplatir contre la lame porte-objets.</li>
	<li>Doucement soulever le glissement de la plaque chauffante et posez-le à plat sur une surface lisse, nivelé, température ambiante, à l’aide de soin de veiller à ce que la cire fondue ne tire pas de part et d’autre de la glissière, jusqu'à ce que la cire solidifie (~ 1 min).</li>
	<li>À l’aide d’une enveloppe de lame de verre, cire hors de diapositives dans quatre lavages de clearing agent de 5 min chacun, à l’aide d’un aspirateur de Büchner pour enlever la solution entre les lavages.</li>
	<li>Laver les lames trois fois en 100 % EtOH pendant 1 min chaque.</li>
	<li>Réhydrater les lames dans une série graduée de l’éthanol dans l’ordre inverse du traitement (95 %, 70 %, 50 % et 25 %) pendant 1 min, que chacune suivie de deux lavages 1 min dans du PBS 1 x.</li>
	<li>Montez immédiatement les sections dans un milieu de montage tampon Tris (voir Table des matières) et appliquer un lamelle couvre-objet, en évitant l’introduction de bulles d’air. Permettre aux milieu de montage polymériser pendant une nuit à température ambiante.</li>
	<li>Une fois polymérisé, scellez la lamelle couvre-objet sur la diapositive à l’aide de vernis à ongles transparent. Scellé de diapositives peuvent être conservés indéfiniment dans l’obscurité à 4 ° c.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Des échantillons de tissus enrobage de paraffine et de coupes minces est une technique histologique classique qui permet l’imagerie des structures micro-morphologiques et est couramment utilisée sur les tissus eucaryotes et a été appliquée avec succès aux échantillons microbiens8 ,,9. Cryoinclusion permet à forte rétention de signal endogène et par immunofluorescence, enrobage de paraffine est généralement préférable car il fournit la meilleure préservation de m...

La plupart des microbes ont la capacité de forme biofilms, communautés de cellules attachées par des matrices auto-produit. Biofilms peut être cultivés dans de nombreux types de configurations physiques, avec différents régimes de disposition des éléments nutritifs et le substrat. Des tests spécifiques pour la formation de biofilm ont tendance à produire des structures multicellulaires reproductibles et architectures courantes sont observées pour des espèces phylogénétiquement diversifiés au niveau macroscopique ou communauté. Lorsque les microbes sont cultivés comme colonies sur milieu solide sous une atmosphère, morphologie macroscopique fournit des informations sur la capacité de production de la matrice et souvent en corrélation avec les autres traits 1,2,3. L’architecture interne des colonies microbiennes peut également fournir des indices sur le biofilm spécifique chimie et physiologie, mais il a été difficile à caractériser. Les applications récentes de techniques Cryoinclusion et cryosectioning aux colonies bactériennes ont permis d’imagerie et de visualisation des caractéristiques spécifiques à une résolution sans précédent de5, 4,6. Cependant, avec les tissus d’origine animale ont démontré que paraffine incorporation prévoit la conservation supérieure de morphologie comparée à Cryoinclusion 7 et a été utilisée pour visualiser des bactéries dans les tissus 8,9. Nous avons donc mis au point un protocole pour la fixation, enrobage de paraffine et découpe fine des colonies microbiennes biofilms. Ici, nous allons décrire la préparation de Pseudomonas aeruginosa PA14 colonie-biofilm minces 10,11, mais nous avons également avec succès appliqué cette technique aux biofilms formés par les bactéries Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, et Vibrio cholerae12.
Le processus d’enrobage de paraffine et de coupes minces biofilms suit une logique simple. Tout d’abord, les biofilms sont entourées d’une couche de gélose pour préserver la morphologie au cours du traitement. Deuxièmement, les biofilms enfermé sont submergées dans un fixateur aux macromolécules crosslink et préserver la micromorphologie. Ceux-ci sont ensuite déshydratés avec de l’alcool, effacés avec un solvant non polaire plus et puis infiltrés avec de la cire de paraffine liquide. Une fois infiltré, les échantillons sont intégrés dans des blocs de cire pour le sectionnement. Sections sont coupées, montées sur des glissières et puis réhydratées afin de retourner à un État plus naturel. De ce point, peut être teintés ou traitées dans le milieu de montage pour analyse microscopique.
Ce protocole produit des coupes minces des biofilms microbiens d’analyse histologique. Sous-structures de biofilm de colonie sont visibles lors de coupes minces préparées à l’aide de cette méthode sont imagés au microscope photonique. Biofilms également peuvent être cultivées sur des taches fluorescentes contenant de médias spécifiques pour les fonctions individuelles ou teintés à la phase de réhydratation, immédiatement avant le montage (étapes 9,5-9,6). Enfin, les microbes peuvent être conçues pour produire des protéines fluorescentes de manière constitutive ou réglementé permettant in situ rapports d’expression de distribution ou un gène cellulaire au sein de ces communautés. Nous avons utilisé ces méthodes pour déterminer la profondeur de biofilm de colonie, distribution cellulaire, distribution de matrice, profils de croissance et expression génique spatio-temporelle.

<table><tbody><tr><td>Pipette Pasteur 5 3/4"</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6A</td><td>Achetée dans les biostores universitaires.</td></tr><tr><td>Agar&nbsp ;</td><td>Teknova&nbsp ;</td><td>A7777</td><td></td></tr><tr><td>Buchner Aspirateur (Vide) Flacon&nbsp ;</td><td>Pyrex</td><td>5340</td><td>Acheté dans les biostores universitaires&nbsp ;</td></tr><tr><td>Stylo de marquage résistant aux produits chimiques</td><td>VWR</td><td>103051-182</td><td>Fabricant : Leica</td></tr><tr><td>Clear Eyenail Polish&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Acheté en magasin</td></tr><tr><td>Congo Red Indicator Grade</td><td>VWR</td><td>AAAB24310-14</td><td>Fabricant : Alfa Aesar</td></tr><tr><td>Coomassie Blue&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>EM-3340</td><td>Fabricant : Support de montage EMD Millipore</td></tr><tr><td>TRIS (avec DAPI)&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50 247 04</td><td>Fabricant : Electron Microscopy Sciences</td></tr><tr><td>Embedding Mold&nbsp ;</td><td></td><td></td> Moule d’enrobage <td>interne imprimé en 3D</td></tr><tr><td>(commercial)&nbsp ;</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>70182</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol 200P</td><td>Decon Labs, Inc.&nbsp ;</td><td>2701</td><td>Acheté dans les biostores de l’université.</td></tr><tr>Pinceau <td></td><td></td><td>à pointe fine</td><td>acheté en magasin, pinceau</td></tr><tr><td>Couvre-lames en verre 60x22mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-519-21C</td><td></td></tr><tr><td>Enveloppe de réhydratation en verre&nbsp ;</td><td>Ted Pella</td><td>21043</td><td>20 publipostage de diapositives&nbsp ;</td></tr><tr><td>Histoclear-II, agent nettoyant à base d’huile d’orange&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50 899 90150</td><td>Fabricant : National Diagnostics&nbsp ;</td></tr><tr><td>Histosette, encastrement Casette</td><td>Fisher Scientific</td><td>15 182 701A</td><td></td></tr><tr><td>chlorhydrate de L-lysine&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP386 100</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microtome à profil bas</td><td>Fisher Scientific</td><td>22 210 048</td><td>Fabricant : Sturkey&nbsp ;</td></tr><tr><td>Micropipette&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>89080-004</td><td>Promo-pack</td></tr><tr><td>Embouts de micropipette&nbsp ;</td><td>Voir la section des commentaires</td><td>Voir la section des commentaires</td><td>p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)</td></tr><tr><td>Microtome&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>905200U/00016050</td><td>Modèle : HM355S, Fabricant : Microm, NON-CATALOGUE, Catalogue du fournisseur # 905200U/00016050</td></tr><tr><td>Formaldéhyde, 37 % aqueux (formol)</td><td>Ricca Chemical</td><td>RSOF0010-500A</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Xtra (cire de paraffine)</td><td>VWR</td><td>15159-486</td><td>Fabricant : McCormick Scientific&nbsp ;</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri carrées 100x100x15mm</td><td>Produits jetables de laboratoire&nbsp ;</td><td>D210-16</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>EMD Chemicals&nbsp ;</td><td>PX1405-1</td><td>Composant d’une solution saline tamponnée au phosphate, préparée sur place&nbsp ;</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P380-500</td><td>Composant d’une solution saline tamponnée au phosphate, préparée en interne</td></tr><tr><td>Lames de rasoir&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Acheté dans les biostores de l’université.</td></tr><tr><td>Chauffe-glissière&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0865259</td><td>NON-CATALOGUE, Catalogue du fournisseur # 12857D</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>0241-1KG</td><td>Composant d’une solution saline tamponnée au phosphate, préparée en interne</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>BDH9296.500,Composant</td> <td>d’une solution saline tamponnée au phosphate, préparée sur place&nbsp ;</td></tr><tr><td>Lames d’histologie Suprafrost</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie à flottation tissulaire&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0815797</td><td>Fabricant : Ted Pella, Catalogue du fournisseur # 28156-B</td></tr><tr><td>Processeur automatique de tissus&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>813160U/Q#00009061</td><td>Modèle : STP120 Processeur de tissu</td></tr><tr><td>Tryptone&nbsp ;</td><td>Teknova&nbsp ;</td><td>T9012</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Teknova&nbsp ;</td><td>Y9010</td><td></td></tr></tbody></table>

enrobage de paraffine et de profilés minces des colonies microbiennes biofilms pour analyse microscopique

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Sectionnement par enrobage de paraffine est une technique largement établie aux systèmes eucaryotes. Ici, nous fournissons une méthode pour la fixation, enrobage et sectionnant des biofilms de colonies microbiennes intact à l’aide de cire de paraffine perfusée. Pour adapter cette méthode pour une utilisation sur les biofilms de colonie, nous ont développé des techniques pour maintenir chaque échantillon sur son substrat de croissance et il laminage avec une surcouche d’agar et lysine a ajouté à la solution de fixation. Ces optimisations améliorent la conservation d’échantillons et de la préservation des caractéristiques micromorphologiques. Les échantillons préparés de cette manière sont prêtent pour fluidifier le sectionnement et imagerie par microscopie photonique, fluorescence et. Nous avons appliqué cette technique à la colonie des biofilms de Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtiliset Vibrio cholerae. Le haut niveau de détail visible dans les échantillons générés par cette méthode, combinée avec la souche journaliste génie ou l’utilisation des colorants spécifiques, peuvent fournir un aperçu passionnant de la physiologie et le développement des communautés microbiennes.

Cette méthode génère minces biofilm dans lequel des caractéristiques morphologiques distinctes et les zones d’expression de gène peuvent être photographiées par DIC, microscopie à fluorescence et TEM. Alors que l’imagerie DIC utilisant un 40 X objectif à immersion d’huile peut être suffisant pour montrer certaines caractéristiques morphologiques (Figure 2E), nous avons trouvé cette fluorescence microscopie des souches machinés pour protéine fluorescente const...

Nous décrivons la fixation, enrobage de paraffine et des techniques de sectionnement minces pour les biofilms de colonies microbiennes. Dans les échantillons préparés, patrons de biofilm sous-structure et reporter d’expression peuvent être visualisées par microscopie.

Enrobage de paraffine et de profilés minces des colonies microbiennes Biofilms pour analyse microscopique

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

L’objectif global de cette procédure est de générer des coupes de biofilm intégrées à la paraffine qui peuvent être utilisées pour évaluer la distribution de l’expression génique telle que rapportée par la production de protéines fluorescentes dans des morphologies natives intactes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans l’étude des communautés microbiennes, telles que l’expression de gènes spécifiques dans la production de substances exopolymères distribuées dans le contexte de l’architecture du biofilm natif. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’analyser l’expression génique dans la morphologie préservée des sections efficaces du biofilm tout en se prêtant aux traitements en aval tels que la coloration de caractéristiques distinctes et l’imagerie à haute résolution telle que la microscopie confocale ou électronique.Après avoir préparé une solution de tryptone d’agar selon le protocole de texte, utilisez un tube conique de 50 millilitres pour verser 45 millilitres de la solution dans une parabole de 100 millimètres sur 100 millimètres carrés. Laissez la gélose se solidifier pendant environ 20 à 30 minutes. Versez une deuxième couche

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Immunology and Infection

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Une méthode pour l'intégration des colonies de levures permettant la coupe pour la microscopie optique et électronique. Ce protocole permet la détermination de la distribution de cellules et les cellules sporulées pseudohyphal au sein des colonies fournissant un nouvel outil pour comprendre l'organisation de types de cellules dans une communauté fongiques.

Méthode d&#39;insertion de levure Colony

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Source : Bucher, T., et al., Méthodologies pour l’étude des biofilms de B. subtilis comme modèle pour caractériser les inhibiteurs de biofilms de petites molécules. J. Vis. Exp.(2016)Cette vidéo montre la préparation de colonies biofilmées bactériennes matures pour l’imagerie haute résolution. Il couvre les étapes de fixation, déshydratation, montage et revêtement métallique afin de préserver et visualiser la morphologie du biofilm.

Préparation des colonies de biofilms bactériens pour l’analyse morphologique

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Cette étude présente le développement de méthodologies reproductibles pour étudier les inhibiteurs de biofilm et leurs effets sur la multicellularité de Bacillus subtilis.

Méthodologies pour l&#39;étude<em&gt; B. subtilis</em&gt; biofilms comme un modèle pour Caractériser Inhibiteurs biofilm petites molécules

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Une nouvelle méthode d&#39;analyse qualitative multi-échelle des bactéries biofilms sur filamenteux Fungal Colonies utilisant confocale et microscopie électronique

Ici, nous fournissons des protocoles détaillés, robustes et complémentaires pour effectuer la coloration et l’imagerie de résolution subcellulaire de modèles de culture cellulaire tridimensionnelle fixes allant de 100 μm à plusieurs millimètres, permettant ainsi la visualisation de leur morphologie, de leur composition de type cellulaire et de leurs interactions.

Coloration et imagerie haute résolution de modèles organoïdes et sphéroïdes tridimensionnels

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Ce protocole propose un flux de travail modulaire BSL-2 combinant des tests de biomasse cristalline-violet, des cinétiques à contraste de phase en accéléré, une cartographie confocale 3D/matricielle, une ultrastructure SEM, et un module d’infection à hamster in vivo pour cultiver, quantifier, caractériser et étudier le rôle fonctionnel du biofilm Leptospira , permettant une évaluation standardisée des mutants et des interventions anti-biofilm à travers les laboratoires.

Un flux de travail modulaire pour l’analyse quantitative, structurelle et fonctionnelle des biofilms de Leptospira

Les cellules formant colonie (CFC) de dosage est un dosage in vitro dans les progéniteurs hématopoïétiques, qui forment des colonies dans un milieu semi-solide. Une combinaison de la morphologie des colonies, la morphologie cellulaire et la cytométrie de flux sont utilisés pour évaluer la capacité des progéniteurs à proliférer et se différencier ainsi les différentes lignées hématopoïétiques.

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Apprenez l'enrobage de paraffine et le profilage mince des biofilms microbiens pour analyser l'expression génique et la morphologie native. Cette technique permet une imagerie haute résolution des communautés bactériennes.

Enrobage de paraffine et de profilés minces des colonies microbiennes Biofilms pour analyse microscopique

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