Enrobage de paraffine et de profilés minces des colonies microbiennes Biofilms pour analyse microscopique

L’objectif global de cette procédure est de générer des coupes de biofilm intégrées à la paraffine qui peuvent être utilisées pour évaluer la distribution de l’expression génique telle que rapportée par la production de protéines fluorescentes dans des morphologies natives intactes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans l’étude des communautés microbiennes, telles que l’expression de gènes spécifiques dans la production de substances exopolymères distribuées dans le contexte de l’architecture du biofilm natif. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’analyser l’expression génique dans la morphologie préservée des sections efficaces du biofilm tout en se prêtant aux traitements en aval tels que la coloration de caractéristiques distinctes et l’imagerie à haute résolution telle que la microscopie confocale ou électronique.

Après avoir préparé une solution de tryptone d’agar selon le protocole de texte, utilisez un tube conique de 50 millilitres pour verser 45 millilitres de la solution dans une parabole de 100 millimètres sur 100 millimètres carrés. Laissez la gélose se solidifier pendant environ 20 à 30 minutes. Versez une deuxième couche de 15 millimètres sur la première couche, puis laissez-la se solidifier pendant la nuit et, si nécessaire, utilisez un mouchoir non pelucheux pour éliminer la condensation des couvercles.

Ensuite, pour repérer les biofilms de colonie, après avoir cultivé une seule colonie isolée de P. Aeruginosa à partir d’un stock congelé selon le protocole de texte, pipetez 2,5 à 10 microlitres de suspension cellulaire sur une plaque bicouche moyenne. Les colonies peuvent être incubées dans l’obscurité à 25 degrés Celsius dans une humidité relative de 80 à 100 % pendant un maximum de quatre jours. Versez doucement 15 millilitres de la solution de gélose sur le milieu de croissance et la colonie et laissez la gélose former un gel à température ambiante pendant cinq minutes.

Ensuite, à l’aide d’une lame de rasoir tranchante, coupez un mandrin carré à trois couches avec la colonie laminée entre les deux couches supérieures. Si vous préparez plusieurs échantillons, assurez-vous que chaque mandrin est coupé à une taille comparable. Retirez délicatement tout excès de gélose de la colonie contenant le mandrin.

Ensuite, mouillez la tête plate d’une spatule dans du PBS ou de l’eau et insérez-la doucement entre les couches supérieure et inférieure de l’agar. Transférez immédiatement la colonie laminée dans une cassette d’enrobage étiquetée avec un stylo de marquage résistant aux produits chimiques. Placez la cassette d’enrobage dans une enveloppe de lames en verre contenant un fixateur préalablement préparé.

Traitez les échantillons. Utilisez 1X PBS pour les laver deux fois pendant une heure chacune. Pour de meilleurs résultats, automatisez l’homogénéisation des réactifs à l’aide du réglage bas de la fonction de spin d’un processeur de tissus automatique.

Pour encastrer les échantillons, remplissez un moule en cire avec de la cire de paraffine fondue chauffée à 55 degrés Celsius, puis utilisez une spatule plate chauffée pour transférer rapidement le mandrin infiltré de la cassette d’enrobage dans le moule à cire en veillant à ce que le mandrin repose parallèlement à la base du moule. Laissez la cire se solidifier pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Les échantillons moulés dans de la cire solide peuvent être stockés indéfiniment à cette température.

Une fois que la cire s’est solidifiée, retirez l’échantillon du moule et utilisez une lame de rasoir pour couper l’excès de cire autour de l’échantillon. Laissez un peu de cire s’étendre d’une extrémité de l’échantillon qui peut être utilisée pour le fixer dans le microtome. Il est important de tailler l’échantillon incrusté de cire de manière à ce que sa forme facilite la collecte de rubans linéaires lisses.

De petites imperfections dans le rognage peuvent produire des artefacts dans le ruban et compromettre l’intégrité de la section. Ensuite, chauffez un bain-marie à 42 degrés Celsius. Ensuite, fixez l’échantillon dans le microtome avec la surface de la colonie orientée perpendiculairement au bord de la lame.

Coupez l’échantillon par intervalles de 50 micromètres jusqu’à ce que le plan souhaité de la colonie ait été atteint, à partir duquel les sections seront prélevées à l’aide d’un microtome réglé à une vitesse de coupe de 75 à 80 tr/min et à un angle de dégagement de six à 10 degrés. Coupez un ruban du nombre souhaité de sections de 10 micromètres d’épaisseur. Ensuite, à l’aide d’un pinceau à pointe fine, détachez le ruban de la lame.

Maintenant, à l’aide d’une pince ou d’une goutte d’eau à l’extrémité d’une pipette Pasteur, transférez doucement le ruban dans le bain-marie. Insérez immédiatement une glissière dans le bain-marie et positionnez-la sous le ruban à un angle de 45 degrés. Touchez le bord étroit du ruban jusqu’à la diapositive située juste en dessous de l’étiquette givrée.

Le ruban doit adhérer. Retirez la glissière du bain-marie et ajustez l’angle pour qu’elle soit perpendiculaire à la surface de l’eau, ce qui permet au ruban de reposer à plat contre la glissière sur toute sa longueur. Évitez de piéger l’excès d’eau sous le ruban.

Placez doucement la glissière sur un mouchoir absorbant non pelucheux en évacuant l’excès d’eau de la section. Ensuite, posez la lame sur une serviette en papier et laissez-la sécher dans l’obscurité à température ambiante pendant la nuit. Chauffez une plaque chauffante nivelée à 45 degrés Celsius et placez la diapositive sur la plaque pendant 30 à 60 minutes.

La cire deviendra semi-fondue et s’aplatira contre la lame. Soulevez doucement la lame de la plaque chauffante et posez-la à plat sur une surface lisse et plane à température ambiante pendant environ une minute jusqu’à ce que la cire se solidifie. Assurez-vous que la cire fondue ne tire pas d’un côté ou de l’autre de la lame.

Avec les échantillons à l’intérieur d’une enveloppe de lames en verre, déparaffiné les lames en quatre lavages d’agent nettoyant pendant cinq minutes chacune. Utilisez un aspirateur Buchner pour éliminer la solution entre les lavages. Utilisez de l’éthanol à 100 % pour laver les lames trois fois pendant une minute chacune.

Ensuite, après avoir réhydraté les lames conformément au protocole de texte, montez immédiatement les sections dans un support de montage tris-tamponné et appliquez une lamelle. La gélose de recouvrement autour de la section ne réagit pas avec le fixateur, elle n’adhère donc pas à la lame de blettes. Cette gélose peut se déloger pendant la réhydratation et endommager la section, il faut donc veiller à ne pas agiter la solution pendant la réhydratation.

Laissez le fluide de montage polymériser à température ambiante pendant la nuit. Une fois polymérisé, utilisez du vernis à ongles transparent pour sceller la lamelle sur la lame. Enfin, conservez les lames scellées indéfiniment dans l’obscurité à quatre degrés Celsius.

Alors que l’imagerie DIC à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile 40 fois peut être suffisante pour montrer certaines caractéristiques morphologiques des sections minces du biofilm, la microscopie à fluorescence des souches modifiées pour exprimer constitutivement des protéines fluorescentes permet une meilleure visualisation de la distribution cellulaire dans les échantillons. Comme le montrent ces panneaux, les images de sections individuelles peuvent être assemblées pour générer une coupe transversale de l’ensemble de la colonie et fournir un contexte pour la localisation des caractéristiques structurelles dans la morphologie globale au niveau macroscopique. L’utilisation d’une souche modifiée pour exprimer une protéine fluorescente sous le contrôle d’un promoteur spécifique permet de visualiser la distribution de l’expression génique.

De plus, les colonies peuvent être cultivées sur un milieu contenant des colorants, ou des colorants peuvent être ajoutés après la section aux polysaccharides spécifiques aux colorants. Enfin, les échantillons peuvent également être préparés et imagés à une résolution plus élevée à l’aide de la microscopie électronique à transmission, comme présenté ici. Il est important, lorsque vous tentez cette procédure, d’être conscient de la disponibilité des échantillons et de la possibilité d’introduire des artefacts fluorescents et structurels, soit par fixation, sectionnement ou réhydratation, ce qui peut influencer votre interprétation des données.

Cette procédure permet une analyse quantitative d’images, telle que la corrélation entre les profils d’expression des rapporteurs fluorescents et les caractéristiques morphologiques et l’axe Z d’un biofilm. Ce protocole peut être appliqué à diverses espèces de microbes formant des biofilms ayant une importance médicale et industrielle, tels que Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae et Bacillus subtilis. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cultiver et de préparer les biofilms de colonie pour la section via l’incorporation de paraffine.