Amélioration de la visualisation et l'analyse quantitative des effets des drogues utilisant des cellules Micropatterned

L’objectif général de la procédure suivante est de montrer comment la normalisation de l’architecture et de la position des cellules obtenue sur des micro-motifs adhésifs spécifiques permet une automatisation facile de l’acquisition d’images et un traitement d’image simple avec une quantification sensible et robuste des effets des médicaments, ce qui est impossible à réaliser sur des supports de lamelles en verre conventionnels. Ceci est réalisé en ensemenceant des cellules héliportées sur deux puces SI qui portent des micro-motifs SI en forme de L trois micro-motifs marqués. Les cellules adoptent la forme triangulaire en construisant une fibre de stress majeure couvrant les deux extrémités du L. Les cellules du motif sont ensuite incubées avec de la statine lebos ou laissées non traitées, puis fixées et colorées pour visualiser le cytosquelette et les noyaux d’acton.

Les images des cellules de micromotifs sont ensuite acquises et traitées à l’aide de la macro cell ref pour générer une pile d’images à analyser et de la macro d’hypoténuse pour quantifier les phénotypes. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent un effet significatif de faibles doses de statine BLE sur les cellules HELOC à micromotifs, ce qui est indétectable dans des conditions de culture cellulaire standard. Bonjour, bienvenue.

Nous sommes ici aujourd’hui pour vous guider à travers notre protocole expérimental, en expliquant comment utiliser des micro-motifs adhésifs pour l’analyse cellulaire, ainsi qu’en vous montrant des données expérimentales illustrant la quantification facile de très faibles doses de médicaments sur ces micro-motifs adhésifs. Ainsi, lorsque vous verrez ces micro-motifs pour la première fois, vous comprendrez immédiatement comment ils peuvent résoudre les problèmes de variabilité dans la capture d’images lors de l’analyse cellulaire. Parce qu’en ayant un véritable réseau de cellules, un peu comme un microréseau, vous pouvez facilement déplacer la platine du microscope d’une cellule à l’autre pour pouvoir capturer des images par étapes.

Mais ce n’est bien sûr pas le seul avantage des micro-motifs qu’il offre. Il offre beaucoup plus d’améliorations car en fait, sur certains micro-motifs typiques tels que le crossbo ou le Y, nous normalisons en fait l’architecture interne de la cellule, c’est-à-dire que les organites, le fuseau mitotique, le cytosquelette et les différents réseaux de protéines sont tous aux mêmes endroits d’une cellule à l’autre ou dans la même orientation d’une cellule à l’autre. Ce qui facilite grandement la prédiction et la quantification des effets des drogues sur ces modèles particuliers. Maintenant, cela peut sembler assez contre-intuitif par rapport à ce qui se fait normalement dans la boîte de Pétri classique ou la microplaque.

Eh bien, parce que vous voyez souvent, bien sûr, des cellules se déplacer et adopter différentes morphologies. Alors que sur les micro-motifs adhésifs, toutes les cellules commenceront à se ressembler parce qu’elles réagissent à ce micro-motif adhésif et organisent leur architecture de la même manière. Cela peut sembler un peu artificiel, mais quand on y regarde de plus près, la boîte de Pétri n’est-elle pas encore plus artificielle ?

Parce que dans les tissus, les cellules sont contraintes par les cellules voisines ainsi que par la matrice extracellulaire. Ils reçoivent donc beaucoup d’informations spatiales, ce qui oriente l’architecture cellulaire. Et c’est ce que nous faisons sur place pour ajouter des micro-motifs.

Nous restituons cette information spatiale aux cellules et toutes les cellules y répondent et s’organisent de la même manière. Et maintenant, parce que les cellules se ressemblent toutes, nous pouvons introduire le concept de cellule de référence, ce qui signifie que nous pouvons faire la moyenne de toutes les images et obtenir une seule image, qui est vraiment représentative de ce à quoi ressemble la cellule dans une condition donnée. Ensuite, vous pouvez ajouter un médicament et regarder à nouveau cette cellule de référence et voir comment elle a modifié la morphologie ou l’organisation de la cellule en réponse à ce médicament.

Placez deux puces situ two individuellement dans deux puits indépendants d’une plaque à six puits, en veillant à ce que le logo situ two soit lisible. Les puces situ deux utilisées pour cette expérience ont des micro-motifs colorés avec FibroGen SI trois et doivent être conservées dans l’obscurité avant utilisation. Prélevez des cellules hela qui sont confluentes à environ 80 % par la trypsine et vérifiez qu’elles sont correctement individualisées sous un microscope, centrifugez à 300 G pendant quatre minutes et suspendez doucement les cellules, comptez et diluez les cellules à une concentration de 15 000 cellules par millilitre.

Dans les milieux de culture incomplets D-M-E-M-F 12, distribuer 60 000 cellules par puits. La plaque doit être déplacée le moins possible pour éviter d’introduire des mouvements de rotation dans le milieu, ce qui aura tendance à concentrer les cellules au centre. Laissez les cellules sédimenter pendant 10 minutes sous le capot, puis déplacez-les vers l’incubateur de cellules.

Dans les 10 à 20 minutes dans l’incubateur cellulaire, les cellules commenceront à adhérer après 10 minutes, vérifiez régulièrement au microscope lorsque les cellules se sont fixées. Changez le milieu cellulaire et retirez l’excédent de cellule en répétant la procédure suivante quatre fois. En gardant la plaque à plat, aspirez doucement le fluide par le côté du puits.

Veillez à conserver suffisamment de support pour éviter que les copeaux ne se dessèchent. Ajoutez quatre millilitres de PBS et aspirez en commençant par le centre de la puce. Ensuite, en vous déplaçant sur le côté du puits pour aspirer la majeure partie du PBS comme auparavant, vérifiez au microscope s’il y a des cellules flottantes.

S’il reste une grande quantité de cellules flottantes, répétez la procédure de lavage. S’il y a très peu de cellules, aspirez une partie du PBS et remplacez-la par deux millilitres de milieu frais et ajoutez quatre millilitres de milieu frais deux fois. Incuber les cellules pendant trois heures dans un incubateur cellulaire pour permettre aux cellules de se propager complètement.

En utilisant cette méthode, entre 10 et 30 % des micro-motifs seront occupés par une seule cellule, tandis que les autres motifs seront soit vides, soit occupés par plusieurs cellules. Pour traiter les cellules avec des statines BLE, diluez la solution mère de 17 millimolaires de médicament à une concentration finale de cinq micromolaires avec 0,1 % de DMSO dans quatre millilitres de milieu. Pour le témoin, préparez le milieu avec 0,1 % de DMSO, aspirez uniquement le milieu cellulaire et remplacez-le rapidement par la statine BLE ou les solutions de contrôle pour éviter que la puce ne se dessèche.

Incuber les cellules pendant une heure à 37 degrés Celsius. Pendant cette incubation, préparez le tampon du cytosquelette. Ajoutez un gramme de saccharose à deux millilitres de cb.

Cela aide à préserver les structures cellulaires internes. Mélangez un millilitre de saccharose CB avec quatre millilitres de PFA à 5 %. Ajouter deux millilitres de PFA dans une solution de saccharose CB.

Dans deux puits d’une plaque fraîche à six puits. Pour fixer les cellules, utilisez une pince pour ramasser la puce CY two et la placer dans la plaque à six puits contenant deux millilitres de PFA dans une solution de saccharose CB. Incuber les cellules pendant 10 minutes à température ambiante, retirer le PFA et laver les cellules une fois avec du PBS, puis laver les cellules avec deux millilitres de chlorure d’ammonium de 100 millimolaires pendant 10 minutes.

Pour éteindre l’activité résiduelle de réticulation du PFA, perméables les cellules en ajoutant deux millilitres de PBS contenant 0,1 % de tritton X 100 pendant trois minutes, lavés deux fois avec des filaments d’actine de coloration PBS avec deux millilitres de ZI conjugués à un à 2000 dans du PBS avec 1,5 % BSA incuber pendant une heure à température ambiante. Ensuite, lavez une fois les cellules avec deux millilitres de PBS. Ensuite, soutenez les noyaux.

Ajouter deux millilitres d’un milligramme par millilitre de PBS et incuber pendant trois minutes à température ambiante. Laver deux fois avec deux millilitres de PBS. Montez les deux puces latérales sur une glissière standard à l’aide de 25 à 30 microlitres de solutions de montage telles que al.

Pour acquérir des images dans trois longueurs d’onde, nous utilisons le logiciel d’imagerie Metamorph et un microscope T à éclipse d’icône NIK. Équipé de la caméra CCD Hema Matsu et d’un illuminateur à fibre de mercure intenstens. Sélectionnez d’abord un grossissement de 20 x.

Ensuite, dans la barre de menus, ouvrez l’acquisition multidimensionnelle. Pour paramétrer les différents paramètres de l’expérience. Indiquez d’abord où enregistrer vos données.

Réglez le nombre de longueurs d’onde sur trois, sélectionnez la longueur d’onde SI trois et positionnez la glissière de recouvrement de manière à ce que 12 micro-motifs soient centrés dans le champ de la caméra. Le nombre de micro-motifs visualisés par champ varie en fonction de la configuration de l’appareil photo et de l’objectif. Réglez le temps d’exposition pour chaque longueur d’onde et mise au point automatique.

Pour PS trois, créez un journal exécutant l’acquisition multidimensionnelle et enregistrez-le en tant que MDA jnl. Ouvrez la fonction d’étape de balayage pour acquérir 24 images contenant chacune 12 micro-motifs. Entrez six colonnes et quatre rangées avec une taille de pas de moins 400 microns x et une taille de pas de 300 microns y dans le journal défini à exécuter, téléchargez le journal MDA jnl press scan pour démarrer l’acquisition automatique des 24 images dans les trois longueurs d’onde.

Dans cette vidéo, les micro-motifs L sont utilisés pour déclencher la formation d’une seule fibre de stress d’actine majeure qui maintient la partie non attachée de la cellule et simplifie la visualisation et la mesure de l’impact de la statine BLE sur les cellules par rapport aux cellules assises sur la fibronectine simple. Pour le traitement et l’analyse automatisés des images, nous décrivons deux macros personnalisées écrites pour l’image du programme open source J à partir d’une pile d’images brutes, la première macro extrait des cellules individuelles et crée une cellule de référence. La deuxième macro mesure l’effondrement de la membrane cellulaire.

La première étape est la segmentation de cellules individuelles à partir d’images brutes. Les images de micro-motifs marquées par fluorescence sont utilisées pour déceler des régions centrées sur les micro-motifs qui sont recadrés sur des images pour chaque longueur d’onde et réassemblés en piles pour chaque longueur d’onde. Pour sélectionner des micro-motifs avec des cellules uniques, la macro détecte le nombre de noyaux par image et élimine de tous les empilements ceux contenant soit plus d’un noyau, soit aucun noyau.

Enfin, le plugin image J multi-stack reg est utilisé pour réaligner toutes les images collectées et tous les canaux en fonction de la position du micropattern. Cette étape génère des piles de lignes d’images individuelles qui peuvent maintenant être utilisées pour l’analyse de cellules uniques ou pour créer une cellule de référence. Dans l’image J, la cellule de référence est construite en faisant une projection des images filtrées et alignées à partir d’une pile.

Plusieurs méthodes de projection peuvent être appliquées, mais une projection médiane est généralement choisie pour éliminer les valeurs aberrantes de la pile d’images. La cellule de référence est un outil unique et utile pour la représentation et l’analyse d’images uniquement obtenue avec des cellules de micromotifs. Pour faciliter son examen, une table de correspondance ou LUT est appliquée pour convertir l’image monocolore en une carte de fréquence codée.

Pour caractériser l’effet statine des BLEs, la rigidité et l’effondrement de la cellule ont été analysés à l’aide d’une deuxième macro d’image J. Brièvement, des images de seuil du micro-motif L sont utilisées pour définir une hypoténuse théorique de la forme du triangle cellulaire. Ensuite, le seuillage des images de coloration d’acton est effectué pour définir la forme de la cellule.

La différence d’aire entre l’hypoténuse théorique et la membrane cellulaire concave réelle est ensuite mesurée : les cellules présentant une aire sous l’hypoténuse théorique sont considérées comme affalées. L’impact de cinq BLE micromolaires a été caractérisé en comparant le nombre de cellules effondrées dans des conditions traitées et de contrôle. Des images typiques de cellules de micro-motifs L traitées avec des statines BLE ou laissées non traitées montrent que les cellules étaient fixes et colorées.

L’actine et les noyaux sont représentés respectivement en rouge, vert et bleu. Notez l’impact des statines BLE sur la forme des cellules par rapport aux conditions de contrôle. Des cellules représentatives après incubation avec des statines BLE ou des contrôles sur la fibronectine simple sont montrées ici.

Les cellules ont été fixées et colorées à l’actine et les noyaux sont respectivement en vert et en bleu. Notez la similitude entre les conditions traitées et contrôlées. Des images typiques de cellules de référence obtenues à partir de cellules traitées avec des statines BLE ou non traitées sont présentées.

Notez le potentiel de cette approche pour une observation facile du phénotype étudié. Voici un exemple d’analyse des effets de la statine BLE sur les cellules à l’aide de la macro-hypoténuse. Alors que 25 % des cellules témoins étaient affaissées, ce chiffre a triplé : 75 % dans les cinq cellules micromolaires BLE traitées aux statines, ce qui reflète l’affaiblissement du réseau contractile d’actinine.

Après avoir regardé ceci, vous devriez maintenant avoir une bonne compréhension de la façon dont les micro-motifs adhésifs résolvent plusieurs goulets d’étranglement dans l’analyse à haut contenu. Tout d’abord, l’utilisation de micro-motifs adhésifs a rendu l’analyse du traitement de capture d’image beaucoup plus simple. Deuxièmement, les micro-modèles permettent de détecter des effets très subtils de médicaments à très faibles doses, car vous réduisez la variabilité d’une cellule à l’autre en normalisant leur morphologie et leur comportement.

Et enfin, par rapport aux milliers de cellules qui sont généralement nécessaires pour obtenir un bon résultat en analyse cellulaire, vous n’avez besoin que de quelques dizaines de cellules pour obtenir un résultat robuste et significatif en utilisant notre cellule de référence.