Analyse simplifiée et à haut débit de la contractilité unicellulaire à l’aide d’élastomères à micromotifs

Ce travail présente un protocole flexible pour l’utilisation de la technologie FLECS (élastomère contractable surfaces élastomères marquées par fluorescence) au format micropuit pour une quantification simplifiée et sans intervention des forces contractiles unicellulaires basées sur des déplacements visualisés de micromotifs de protéines fluorescentes.

Les forces mécaniques générées par les cellules sont essentielles au bon fonctionnement de divers organes du corps. Plus les intestins de la vessie, du cœur et d’autres. Ces organes doivent générer des schémas stables de contraction et de relaxation cellulaires, pour maintenir l’état hémostatique interne.

Une contraction anormale des cellules musculaires lisses peut entraîner l’apparition de divers troubles, y compris la dysmotilité intestinale caractériser des schémas anormaux de contraction intestinale avec muscle, ainsi que des conditions telles que la vessie hyperactive ou sous-active. Et dans les voies respiratoires, certaines cellules musculaires qui contractent des schémas irréguliers peuvent déclencher une hyper réactivité asthmatique. De toute évidence, les mécanismes contractiles dans les cellules et les tissus peuvent conduire à des maladies qui nécessitent des options de traitement.

Et comme ces conditions peuvent provenir directement de comportements contractiles dysfonctionnels des cellules, il devient à la fois logique et nécessaire de mesurer la fonction contractile cellulaire elle-même, lors du dépistage de candidats médicaments potentiels. Suite aux progrès récents de la microtechnologie, nous avons développé un test convivial basé sur des microplaques qui permet des mesures quantitatives de la contraction d’une seule cellule. Dans des centaines de milliers de cellules appelées flex, également connues sous le nom de surfaces contractables élastomères marquées par fluorescence.

Dans cette approche, nous intégrons des micro-motifs de protéines fluorescentes, et donc des films mous, qui se déforment et rétrécissent lorsque les cellules leur appliquent des forces de traction. Il est important de noter que les micro-modèles protéiques limitent la position, la forme et la zone de propagation des cellules. Les conditions d’essai uniformes et permettent des mesures simples basées uniquement sur leurs changements dimensionnels.

Dans l’ensemble, la plate-forme, qui comprend un module d’analyse d’images basé sur un navigateur, permet une analyse simple de la force cellulaire contractable sans nécessiter de procédures de manipulation délicates ou d’enregistrement de marqueurs fiduciaires et peut être utilisée par n’importe quel chercheur avec les cultures cellulaires de base et un microscope fluorescent simple à faible grossissement. Cette technologie est conçue en pensant à l’utilisateur final et vise à réduire la barrière à l’entrée pour tout scientifique de laboratoire pour étudier la biologie de la force cellulaire Commencez par ajouter 20 millilitres de milieu dans un tube chronique, obtenez une plaque de 24 puits conçue pour tester la contractilité cellulaire. Réglez votre pipette à 500 microlitres et obtenez une passoire cellulaire pour l’agent pathogène cellulaire.

Retirez le couvercle de la plaque à 24 puits, maintenez la plaque comme suit, puis retirez doucement la couche de plastique sur le dessus de la plaque. Remettez soigneusement la plaque vers le bas. Aspirez simplement la couche supérieure de PBS de chaque puits pour éviter tout déversement.

Maintenant, une rangée à la fois, retirez le PBS restant du puits et remplissez-le rapidement avec 500 microlitres de milieu cellulaire. Secouez doucement la plaque et tapotez sur le côté pour vous assurer que tout le fond du puits est recouvert de solution. Une fois que tous les puits ont été remplis de supports, placez la plaque sur le côté.

À ce stade, récupérez votre culture cellulaire de l’incubateur. Nous mènerons un solide protocole d’association. Le but de ce protocole est de créer une suspension de 50 000 cellules par millilitre.

Avant d’ensemencer les cellules, assurez-vous de filtrer vos cellules une fois à travers la passoire, afin de briser les amas de cellules en cellules uniques, placez soigneusement 500 microlitres de votre solution cellulaire dans chaque puits. Après l’ensemencement des cellules, il est important de laisser les plaques reposer pendant une heure afin que les cellules puissent se déposer directement sur les motifs. Après une heure, placez l’assiette dans un incubateur pendant la nuit.

La deuxième partie de l’expérience consiste à ajouter les médicaments à la plaque de 24 puits et à l’imagerie fluorescente de la plaque. Pour cette partie du protocole, nous avons deux exigences importantes pour assurer une viabilité et une réponse cellulaires robustes. La première est que la concentration finale de DMSO dans les puits avec cellules n’est pas supérieure à 1%, ce qui signifie que nous devons faire une dilution complète de 100 à partir de nos stocks de médicaments.

La seconde est que nous ne pouvons pas ajouter du DMSO si directement aux puits parce qu’il s’écrasera au fond de ce mélange, puis endommagera les cellules avec une concentration de niveau élevé. Au lieu de cela, nous devons créer une solution intermédiaire de médicament et de milieuX DMS0, que nous pouvons mélanger soigneusement ensemble pour éviter une exposition locale élevée au DSSO aux cellules. Dans ce protocole, nous effectuerons une dilution octuple en six étapes qui couvre une gamme allant de 40 micromolaires à une nanomolaire Créez la série de dilution octuple en six étapes en transférant 30 microlitres de solution médicamenteuse mère dans des volumes consécutifs de 210 microlitres de DMSO et en mélangeant soigneusement entre chaque étape de transfert Dans notre expérience, nous évaluerons l’effet de la blébbistatine.

sur les vessies humaines à travers les cellules musculaires. Afin de répondre à ces deux exigences, nous allons d’abord créer un médicament intermédiaire DMSO et une solution de média. Cela donne une dilution de 16,7 fois du DMSO.

Ensuite, nous ajouterons cette solution médicamenteuse intermédiaire à nos cellules, en utilisant des proportions donnant une dilution supplémentaire de six fois, résultant en une dilution complète totale de 100 et la concentration finale de 1% de DMSO Pour ce faire, pour chaque solution médicamenteuse mère, mélanger 30 microlitres de médicament dans 470 microlitres de milieu de culture cellulaire, puis transférer 200 microlitres de cette solution intermédiaire au puits approprié sur la plaque de 24 puits, qui contient 1000 microlitres dans chaque puits. Cela donne collectivement une concentration finale de 1% d’incubé de DMSO pendant la durée appropriée. Dans notre expérience, nous incubons pendant 30 minutes, lorsque vous êtes prêt à imager, ajoutez une tache nucléaire vivante sur tout votre puits, ajoutez une dilution d’une à 10 000 du stock.

Laissez-le incuber pendant 15 minutes supplémentaires. Lorsque vous êtes prêt à imager, vous aurez besoin d’un microscope fluorescent équipé pour imager les canaux fluorescents pour les noyaux cellulaires marqués et le colorant fluorescent. Les micro-motifs sont étiquetés avec lesquels dans notre exemple est le canal tri C.

Maintenant, nous allons imager les noyaux de blébbistatine par imagerie fluorescente afin d’identifier des cellules individuelles, assurez-vous d’imager les noyaux de cellules tachées exactement dans la même position que vous visualisez le micro-motif afin qu’ils puissent être alignés pendant l’analyse. Téléchargez les images acquises sur votre ordinateur en vous assurant que les images sont étiquetées correctement, de sorte que les couches de motif se terminent par un trait de soulignement PT. Et les images dans le canal nucléaire se terminent par une dapi de soulignement. Maintenant, nous allons convertir les images tif en images PNG, en utilisant l’image J Une fois que l’image J est ouverte, chargez-les dans un canal à la fois.

Nous allons d’abord charger le canal de motif et ajuster le contraste, afin de maximiser le signal et de minimiser l’arrière-plan. De plus, nous allons lisser l’image. Une fois que l’image a été modifiée à notre goût, nous allons alors changer le type d’image à huit bits.

Exportez ensuite l’image au format PNG. Cochez ensuite la case, utilisez des étiquettes de tranche comme noms de fichiers. Créez un nouveau dossier appelé PNG.

Ensuite, enregistrez les fichiers PNG là-bas, Pour analyser les images, accédez à Biodock dot AI, créez un compte et contactez les auteurs pour accéder gratuitement au module d’analyse. Connectez-vous une fois votre compte créé. Ici, vous pourrez télécharger de nouvelles images.

Nous appellerons ce nouveau lot, données d’expérience Web JoVE. Maintenant, nous pouvons importer les images en les faisant glisser puis en les déposant, appuyez sur OK.At ce stade, sélectionnez vos données. Cliquez ensuite sur Analyser, faites défiler jusqu’au module intitulé Analyse de contractilité, puis appuyez sur Sélectionner.

Réglez le grossissement sur la même valeur que celle que vous avez utilisée pour l’imagerie Une fois les données terminées, cliquez dessus, puis nous pouvons sélectionner les données de téléchargement. Une fois les données téléchargées, nous pouvons alors voir des paires d’images superposées pour chaque image saisie. Nous avons également accès à une statistique sommaire qui nous donnera la contraction moyenne pour chaque ensemble de cellules.

L’unité de mesure de la contraction est en pixels. En regardant les données, nous pouvons voir ici que dans les puits traités avec du DMSO seulement, il y avait une contraction beaucoup plus élevée des cellules par rapport aux cellules qui ont été traitées avec de la blébbistatine. Nous avons également accès aux données pour chaque motif détecté dans l’une des images.

Cela nous donne des informations détaillées concernant l’emplacement de l’image, l’origine de l’image, le type de position, le nombre de cellules, zéro une ou plus d’une, la taille du micro-motif et la contraction calculée des cellules. Cette pose se compose de chaque motif identifié dans la microplaque. Les modèles à cellule unique de cette liste étaient moyens pour calculer la contraction moyenne de l’image PNG dans l’autre fichier.

Vous pouvez trier et analyser les données d’une seule cellule selon les besoins de votre expérience. Pour cette partie de la vidéo, nous afficherons des données représentatives qui peuvent être collectées à partir d’une plaque de 24 puits montrant ces données de réponse provenant de cellules musculaires lisses de la vessie traitées avec deux médicaments différents. Ce sont des images de puits traités respectivement avec du DMSO et de la blébbistatine.

Ici, nous pouvons voir que les cellules traitées avec DMSO seulement, présentent un grand nombre de micro-modèles contractuels, mais les cellules traitées avec de la blébbistatine étaient plus grandes et ouvertes à noter qu’il y a moins de contraction. Les données de cet histogramme affichent la contractilité des cellules de variation résultant des différents traitements des cellules. Le centre de distribution des cellules traitées avec de la blébbistatine est inférieur au centre de distribution des cellules traitées avec le DMSO.

Ceci est cohérent avec les informations affichées dans les images précédentes. Parce que les cellules qui ont été traitées avec de la blébbistatine ont montré une contraction beaucoup plus faible. Cela signifie que le traitement avec de la blébbistatine détend considérablement les cellules.

Chacun de ces ensembles de données contribue à un point de la courbe dose-réponse qui peut être collecté à partir d’une seule plaque de 24 puits, en suivant les protocoles présentés dans la vidéo. Ici, nous pouvons voir que la cytochalasine D est plus puissante que le blebbistan, comme le montrent les valeurs plus faibles de contraction, compte tenu des concentrations plus élevées de médicament. Si vous souhaitez mettre à l’échelle vos expériences de manière significative, une version à plaque de puits 384 est disponible, et cela peut être utilisé avec l’automatisation pour mettre à l’échelle considérablement les expériences.

Ces données sont collectables à partir d’une plaque de puits 384, plutôt que d’avoir six étapes de dilution pour chaque médicament sur la plaque de 24 puits, la plaque de puits 384 nous permet d’effectuer 20 étapes de dilution pour chaque médicament avec plusieurs répliques. La technologie des flocons de neige est unique. Il permet de visualiser la contraction unicellulaire à l’aide de la microscopie, ce qui a été impossible jusqu’à présent.

Ainsi, la technologie repose sur la forme de métriques qui est modelée avec des protéines marquées par fluorescence. Le modèle systématique est à former pour la contraction cellulaire et permet une mesure précise de la modulation d’un contrat de phénotype par un médicament donné. Bien sûr, cette technologie est toujours activement développée pour des applications et de nombreux domaines pathologiques différents, tels que l’asthme, les maladies cardiovasculaires, l’oncologie immunitaire inflammatoire et, bien sûr, toute indication de notre maladie où une contraction cellulaire anormale joue un rôle clé dans la progression de la maladie.

Comme nous le démontrons, cette technologie basée sur le micro-motif pour mesurer la contractilité cellulaire offre une alternative simplifiée à la microscopie à force de traction traditionnelle, fournissant une analyse intuitive, observant le rétrécissement du motif et fournissant une résolution de cellule unique dans de grandes populations cellulaires. Certaines considérations, cette méthode peut poser des défis pour l’utilisation de cellules qui sont soit trop petites, telles que les cellules T et les neutrophiles, ou des types de cellules qui n’adhèrent pas. De plus, les cellules qui se lient chaque semaine, se lient les unes aux autres principalement ou qui ne se propagent pas complètement, ne produiront pas de signaux contractiles mesurables.

Les utilisateurs de la technologie doivent évaluer soigneusement différentes formulations possibles de milieux de culture cellulaire pour leur type de cellule particulier. car différents composants, facteurs de croissance, taux sériques et sensibilités au pH peuvent entraîner des comportements variables. L’optimisation des protocoles devrait procéder à la mise à l’échelle de tous les flux de travail expérimentaux.

En fin de compte, si la résolution d’une seule cellule n’est pas nécessaire, ou si le type de cellule cible a une capacité d’étalement minimale, les méthodes traditionnelles de microscopie à force d’attraction peuvent être utilisées pour de telles expériences. Sinon, nous espérons que cet outil fournira une avenue supplémentaire aux biologistes cellulaires pour étudier la contraction cellulaire et effectuer leurs études.