Un dispositif microfluidique pour l'étude de plusieurs souches distinctes

L’objectif global de la méthode suivante est d’imager le comportement de cellules uniques de différentes souches de levure dans les mêmes conditions dynamiques. Ceci est réalisé en fabriquant un dispositif microfluidique à deux couches, ou la couche inférieure contiendra chacune des différentes souches séparément, et la couche supérieure fournira les conditions d’écoulement dynamiques dans un deuxième temps. Différentes souches de levure sont placées dans les puits et l’appareil est fermé, créant ainsi un seul canal avec plusieurs souches séparées.

Ensuite, nous imaginons les réponses des cellules aux changements dynamiques du milieu En contrôlant les débits dans les deux entrées du canal Y, les résultats montrent différentes souches soumises aux mêmes conditions dynamiques et sans contamination croisée entre les puits. Ce dispositif microfluidique présente plusieurs avantages clés par rapport aux autres systèmes existants. Il permet d’imager plusieurs souches distinctes dans les mêmes conditions dynamiques.

De plus, il peut être fabriqué facilement dans n’importe quel laboratoire sans avoir besoin d’équipement spécial. Cette méthode est née d’une discussion sur la façon de suivre les réponses de différents isolats sauvages de l’Est aux passes de famine. Commencez, dessinez ou imprimez la disposition de microcanaux souhaitée à l’échelle.

Ensuite, couvrez une diapositive de verre avec des couches de ruban adhésif Pour atteindre la hauteur souhaitée du canal, placez le motif de mise en page sur une surface plane et alignez la diapositive sur le motif de conception. Maintenant, coupez soigneusement le ruban adhésif sur la diapositive de verre selon la disposition. Retirez le scotch de toutes les régions de la lame de verre.

Acceptez-les dans la disposition du micro canal. Placez la diapositive dans un four chauffant à 65 degrés Celsius pendant trois minutes. Nettoyez ensuite délicatement avec de l’éthanol.

Mélangez la base et les composants de durcissement du PDMS comme recommandé par le fabricant. Versez environ 30 millilitres de mélange PDMS dans une boîte de Pétri à une hauteur d’environ 0,5 centimètre. Dégazez le PDMS sous vide si nécessaire.

Immergez la glissière de verre dans le PDMS avec le ruban adhésif à motifs vers le haut. Placer le motif après le PDMS empêche la formation de bulles d’air entre la lame et la parabole Durcit par le fond pendant 48 heures à 65 degrés Celsius, en s’assurant que la parabole est horizontale à l’aide d’un niveau à bulle dans une nouvelle boîte de Pétri de 90 millimètres. Versez trois millilitres de mélange PDMS.

Cette étape peut être effectuée sur un codeur de spin si disponible. DGA et cure comme indiqué précédemment. Maintenant, découpez doucement la couche d’écoulement du dispositif microfluidique à la taille souhaitée à l’aide d’un perforateur à biopsie.

Créez des trous pour les entrées et les sorties dans la couche d’écoulement. Découpez également une couche de puits de taille similaire dans la deuxième boîte de Pétri et placez-la sur un verre épais. Faites glisser la mise en page du design.

Ensuite, percez les puits dans l’alignement des microcanaux sur la disposition à l’aide d’éthanol, nettoyez les deux couches PDMS et une lamelle en verre et séchez à l’air. Ensuite, traitez la lamelle de couverture en verre et la couche de puits PDMS avec soit un graveur plasma standard pour un collage non réversible, soit un traitement corona portable pour un collage réversible. Placez soigneusement la couche de puits sur la lamelle de recouvrement pour provoquer une adhérence.

Frottez doucement les bulles d’air. Préparez le fluide souhaité dans des seringues appropriées et connectez-le à un tube tigon enfilé dans un pousse-seringue. Pour l’imagerie cellulaire.

Utilisez les points forts. Passez à la phase souhaitée, vortex la culture à fond et transférez 300 microlitres dans des micro-tubes à centrifuger. Placez délicatement un microlitre de con canna A dans chaque puits de la couche de puits PDMS.

Lavez l’excès de cône A de chaque puits deux fois en pipetant doucement l’eau pendant que le cône de A sèche. Lavez les souches deux fois avec 300 microlitres de milieu SC manquant de glucose. Le lavage du glucose résiduel des parois cellulaires aide à une bonne adhérence à la convalescence.

Dans un post-vortex, les cellules pipetent soigneusement environ 0,5 microlitre de la suspension cellulaire dans des puits individuels. Lavez doucement les cellules résiduelles avec un milieu riche. Les deux étapes suivantes doivent être effectuées rapidement afin d’éviter le dessèchement des cellules.

En tant qu’étape plasma facultative, traitez la puce et les puits en faisant attention de ne pas frapper directement les puits. Ensuite, sous un stéréoscope, placez soigneusement la puce sur les puits en faisant très attention à l’alignement entre les deux. Appuyez doucement pour faire adhérer les deux couches de PDMS.

Remplissez lentement l’appareil complètement avec environ 50 microlitres de milieu riche, en vous assurant qu’aucune bulle d’air ne reste à l’intérieur du canal. Connectez maintenant l’appareil en insérant les tubes dans les entrées appropriées et démarrez le flux de fluide. Veillez à ce qu’aucune bulle d’air ne se forme dans le tube, car celles-ci peuvent se coincer dans l’appareil et détruire le flux.

Placez l’appareil sous un microscope et trouvez les points d’imagerie appropriés dans chacun. Eh bien, gardez les cellules sous un flux riche et moyen pendant une heure ou plus si nécessaire. Pour permettre la récupération.

Démarrez l’expérience avec le réglage de débit constant. Pompez A à 0,8 millilitres par heure et pompez B à 0,2 millilitres par heure. Pour le moyen, un écoulement supérieur à 80 % de la largeur du canal.

Nous pouvons modifier dynamiquement les conditions de l’appareil en modifiant les débits relatifs. Les nouvelles conditions se stabilisent en quelques secondes sur l’ensemble du canal pour démontrer la séparation entre les différentes souches. Deux souches de levure distinctes sont imagées dans des puits alternés.

Notez qu’il n’y a pas de fuite de cellules entre les puits dans cette expérience. Les deux souches ont le facteur de transcription MSN deux marqué avec YFP pour tester l’effet simultané de conditions changeant dynamiquement. Les débits dans les deux canaux d’entrée ont été modifiés pour créer un pas de milieu sans glucose.

Cela a entraîné la localisation de MSN deux dans le noyau. Il est important de noter que la trace temporelle des niveaux nucléaires de MSN deux YFP dans des cellules uniques peut être analysée. Ainsi, le dispositif microfluidique PDMS peut être utilisé pour l’application de conditions dynamiques simultanées à plusieurs puits.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas laisser les cellules se dessécher lors de l’assemblage de l’appareil. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée facilement sans avoir besoin de lithographie douce.