Name: Un dispositif microfluidique pour létude de plusieurs souches distinctes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Découvrez une méthode d'imagerie microfluidique pour étudier simultanément plusieurs souches de levure sous conditions dynamiques identiques. Ce dispositif bicouche prévient la contamination croisée et simplifie l'expérimentation cellulaire.

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YG est soutenu par une bourse de la BID. IN est un garçon Alon et membre du corps professoral du ‭ Edmond J. ‬ Safra Center for Bioinformatics Université de Tel Aviv ‭. ‬ Cette recherche a été financée par l&#39;ISF subvention 1499/10.

1. Création d&#39;un Master Scotch-ruban 5 <ol><li> Dessiner ou imprimer souhaité mise à microcanaux, à l&#39;échelle sur du papier. Dans notre cas, la conception se compose de deux canaux en Y, chacun 3 mm de large (figure 2). </li><li> Couvrir d&#39;un verre coulissant avec des couches de scotch. Le nombre de couches détermine la hauteur du canal (environ 60 um par couche). Nous avons utilisé 3 couches scotch. </li><li> Placer le schéma de configuration sur une surface plane. Aligner la glissière sur le modèle de conception. Découpez soigneusement le ruban adhésif sur la lame de verre avec un scalpel en fonction de la mise en page. </li><li> Enlever le scotch de toutes les régions de la lame de verre, sauf ceux de la mise en page du microcanal. </li><li> Placer la lame dans un four de chauffage à 65 ° C pendant 2-3 min. Nettoyer délicatement avec de l&#39;éthanol. </li></ol> 2. Fabrication d&#39;un dispositif microfluidique PDMS <ol><li> Mélanger la base et composants durcisseurs de PDMS comme recommandé par le fabricant. Nous utilisons une 10:01rapport de la base à l&#39;agent de durcissement. Verser environ 30 ml de mélange PDMS dans une boîte de Petri à une hauteur de ~ 0,5 cm. Dégazer le PDMS dans le vide si nécessaire. Plonger la lame de verre dans le PDMS avec du scotch à motifs vers le haut. Placer le motif après le PDMS empêche la formation de bulles d&#39;air entre la lame et le fond plat. Cure de 48 h à 65 ° C, en s&#39;assurant que le plat est à l&#39;horizontale à l&#39;aide d&#39;un niveau à bulle. </li><li> Dans un nouveau plat de Pétri de 90 mm verser 3 ml de mélange PDMS, résultant en une couche d&#39;environ 0,5 mm de profondeur. (Si la tournette est disponible, il peut être utilisé pour cette étape). </li><li> Degas et guérir qu&#39;en 2.1. </li><li> Découper délicatement le dispositif microfluidique à la taille désirée avec un scalpel. Cette couche sera appelée &quot;couche d&#39;écoulement&quot;. </li><li> Découpez un morceau de taille similaire de couche mince PDMS à partir du second plat de Pétri. Ce sera dite &quot;couche de puits&quot;. </li><li> Utiliser un perforateur de taille appropriée biopsie (On utilise 1,2 mm de diamètre) à percer des trous pour les entrées et les sorties de la couche d&#39;écoulement. </li&gt; <li> Placer la couche de puits sur une lame de verre d&#39;épaisseur sur la configuration d&#39;poinçon et hors des puits, en utilisant 2 mm ID biopsie perforateur, en alignement avec les micro-canaux sur la mise en page. </li><li> Nettoyer les deux couches de PDMS ainsi que de couvre un verre 24 mm x 60 mm avec de l&#39;éthanol. Sécher à l&#39;air et à garder propre. </li><li> Plasma traiter à la fois la lamelle de verre et la couche de PDMS puits en utilisant soit graveur plasma standard (pour les non-réversible collage) ou un dispositif de traitement à main corona 6 pour collage réversible. Placer soigneusement la couche de puits au-dessus de la lamelle couvre-objet pour provoquer l&#39;adhérence (figure 3). Frottez doucement les bulles d&#39;air (si nécessaire). </li></ol> 3. Expérience d&#39;imagerie cellulaire <ol><li> Assurez-vous que le support souhaité dans des seringues prêtes appropriés reliés à des tubes en plastique flexibles d&#39;un diamètre intérieur de 0,02 &quot;(Tygon) dans la pompe seringue. </li><li> Cultivez S. cerevisiae à la phase désirée dans YPD liquide. Vortex fond et lieu à 300 μl de chaque souche dans un tube à centrifuger. </li><li> Placez délicatement 1 pl de la concanavaline A (sigma) 2 mg / ml dans chaque puits. Laver la concanavaline A l&#39;excès de chaque puits deux fois par pipetant doucement l&#39;eau. </li><li> Alors que la concanavaline A est le séchage, laver deux fois avec 300 souches ul de milieu SC dépourvu de glucose. Lavage du glucose résiduel à partir des parois cellulaires permet une bonne adhérence à la concanavaline A. </li><li> Vortex cellules à fond. Pipeter 0,75 pi ou moins de chaque suspension cellulaire dans son propre puits (figure 3). Lavez délicatement les cellules résiduelles avec un milieu riche. Les deux étapes suivantes doivent être effectuées rapidement afin d&#39;empêcher les cellules de se tarir. </li><li> Plasma traiter la puce et les puits à fond en utilisant l&#39;appareil de traitement corona à main, en faisant attention de ne pas frapper directement les puits. Placez délicatement la puce sur le puits, en accordant une attention particulière à l&#39;alignement entre les deux (cette étape peut être effectuée sous un stéréoscope). Appuyez doucement sur pour faire adhérer les deux couches de PDMS. Remplir lentement l&#39;appareil complètement avec environ 50 ul milieu riche en s&#39;assurant qu&#39;aucune bulle d&#39;air ne reste dans le canal. </li><li> Connectez l&#39;appareil, insérer les tubes dans les entrées appropriées et commencer à flux média. Veillez à ce que les bulles d&#39;air sont introduits dans l&#39;appareil, car ils peuvent être difficiles à enlever, ce qui peut être accompli en débranchant une entrée ou de sortie et en tapotant doucement sur le périphérique où les bulles sont, en faisant attention de ne pas casser la lamelle de verre. </li><li> Placez-le sous microscope et trouver des points d&#39;imagerie appropriées dans chaque puits. </li><li> Maintenir les cellules dans un milieu riche écoulement pendant 1 heure ou plus pour permettre la récupération en cas de besoin. </li><li> Commencez l&#39;expérience: nous utilisons flux constant de chacun des deux pompes à seringues pour empêcher le retour des médias, en changeant les débits relatifs au choix. A la mise en pompe à 0,8 ml / h et la pompe B et 0,2 ml / hr élément de support d&#39;un écoulement au-dessus de 80% de la largeur de la chaîne (figure 4). Cela peut être dynamiquement cpendu en changeant les deux débits. Stabiliser les nouvelles conditions dans les secondes sur toute la longueur de la chaîne 2. </li></ol>

<ol><li>Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+of+substrate-bound+laminin+orient+axonal+specification+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12542-12547 (2002).</li>
<li>Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+processing+by+the+HOG+MAP+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Signal processing by the HOG MAP kinase pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7165-7170 (2008).</li>
<li>Paliwal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK-mediated+bimodal+gene+expression+and+adaptive+gradient+sensing+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast.</a> Nature. 446, 46-51 (2007).</li>
<li>Bennett, M. R., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+measuring+gene+network+dynamics+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for measuring gene network dynamics in single cells.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 628-638 (2009).</li>
<li>Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Fabrication+of+Microfluidic+Devices+by+Replicating+Scotch-tape+Masters%5BTitle%5D)+AND+%22Chips+%26+Tips%22%5BJournal%5D)">Simple Fabrication of Microfluidic Devices by Replicating Scotch-tape Masters.</a> Chips & Tips. , (2010).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).</li>
<li>Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+microfluidic+approach+to+generating+protein-interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks.</a> Nat. Methods. 6, 71-74 (2009).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dans cet article, nous présentons une méthode de paillasse simple pour créer un dispositif microfluidique qui permet suivants souches de levures plusieurs simultanément dans des conditions dynamiques. Après plusieurs souches dans un canal fournit un outil fiable pour comparer la dynamique des réponses des cellules individuelles dans des souches multiples. Un avantage de notre approche est la capacité à fabriquer le dispositif avec des techniques simples, sans la nécessité d&#39;une salle blanche. En fait, nous avons éga...

Les cellules sont constamment réagir à un environnement changeant dynamiquement, en changeant leur métabolisme, profil transcriptionnel et fonctions cellulaires. Pour étudier ces phénomènes, les méthodes qui permettent de quantifier ces changements sont nécessaires. Un type de lecture de ces réponses est le changement dans la localisation des facteurs de stress liés à la transcription en réponse à un stress nutritionnel. Dispositifs de microfluidique 1 ont été utilisés pour manipuler dynamiquement des conditions environnementales dans les cellules 2-4. Ils présentent plusieurs avantages pour l&#39;imagerie de cellules vivantes: l&#39;environnement des cellules peuvent être contrôlées avec précision et dynamique a changé, les cellules peuvent être imagée en direct à tout moment, y compris lors de la manipulation des conditions extérieures, et des volumes de réactifs minimales sont requises. Une conception très simple pour un dispositif microfluidique, permettant une alternance entre deux conditions, est un dispositif en forme de Y 2. Nous utilisons régulièrement en forme de Y dispositifs microfluidiques qui permettentapplication des changements dynamiques aux cellules dans le canal. Nous utilisons ce dispositif pour suivre les changements de localisation des facteurs de stress marquées par fluorescence de transcription liés à des cellules de levure. Nous suivons ces changements dans l&#39;évolution des conditions nutritionnelles. Par exemple, nous pouvons fournir une impulsion (ou une série d&#39;impulsions) de glucose milieu contenant dans un délai de plus de glucose et moyen terme, à une résolution temporelle très fine. Souvent, dans ces expériences, on est intéressé à comparer les réponses des souches cellulaires différentes (par exemple, différents mutants ou différents isolats sauvages). Le canal en forme de Y est limitée à une souche dans chaque canal - si plus d&#39;une souche est utilisé, il n&#39;existe pas de moyen simple de faire la distinction entre les souches. Pour remédier à cela, les différents canaux peuvent être utilisés. Si nous voulons appliquer les mêmes conditions dynamiques de plusieurs souches, nous tenons à associer le concept Y-canal avec de multiples canaux. Il ya deux défis dans la mise en œuvre de cette solution: Il peut être difficile d&#39;appliquer til mêmes conditions en même temps à tous les canaux, et il existe une limitation géométrique au nombre de canaux en Y qui peuvent être montés dans un seul appareil. Nous avons donc cherché un moyen pour visualiser plusieurs souches dans un canal dans des conditions dynamiques. Ici, nous décrivons un dispositif à deux couches microfluidique destiné aux souches d&#39;imagerie multiples dans un canal dans les mêmes conditions dynamiques. La couche inférieure est constituée de couches minces PDMS avec une rangée de trous. Cette couche est attachée à la lamelle de verre créant des puits dans lequel nous allons placer les différentes souches, les faire adhérer à la concanavaline A sur le verre. La seconde couche est un dispositif en forme de Y microfluidique créé en utilisant la méthode du ruban adhésif 5. Après avoir placé les souches dans les puits de la seconde couche est rapidement alignée et fixée à la première, la création d&#39;une chaîne de plusieurs puits qui contiennent les différentes souches. Ce dernier dispositif permet de suivre plusieurs souches dans un canal, où tous lessouches sont soumis aux mêmes conditions à la même heure. Toute la conception et de la production qui peut être fait sur la paillasse, avec des moyens simples, sans la lithographie douce.

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif / équipement </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> PDMS-Sylgard 184 </td><td> Dow Corning USA </td><td></td></tr><tr><td> Dessiccateur à vide </td><td> Nalgene </td><td> 5310-0250 </td></tr><tr><td> Biopsie puncheurs </td><td> Ted Pella Inc </td><td> Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15 074 (1,2 mm) </td></tr><tr><td> Pompes à seringues </td><td> Chemyx </td><td> Fusion 200 </td></tr><tr><td> Corona purificateur </td><td> Electro-techniques des produits </td><td> BD-20 </td></tr><tr><td> Tuyau Tygon </td><td> Tygon </td><td> S-54-HL </td></tr><tr><td> Concanavaline-A </td><td> Sigma </td><td> C7275 </td></tr><tr><td> Ruban adhésif </td><td> 3M Scotch </td><td> Ruban transparent 1/2 &quot; </td></tr></tbody></table>

un dispositif microfluidique pour l&#39;étude de plusieurs souches distinctes

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

L&#39;étude des réponses cellulaires aux changements environnementaux pose de nombreux défis expérimentaux: les cellules doivent être imagé dans des conditions changeantes, souvent de manière comparative. Plaques multipuits sont couramment utilisées pour comparer différentes souches ou des lignées cellulaires, mais de permettre un contrôle limité sur la dynamique de l&#39;environnement. Dispositifs microfluidiques, d&#39;autre part, de permettre exquise contrôle dynamique des conditions environnantes, mais il est difficile d&#39;image et de distinguer plus de quelques souches en eux. Nous décrivons ici une méthode pour fabriquer facilement et rapidement un dispositif microfluidique capable d&#39;appliquer les conditions changent dynamiquement à de multiples souches de levures différentes dans un même canal. L&#39;appareil est conçu et fabriqué par des moyens simples, sans la nécessité d&#39;une lithographie douce. Il se compose d&#39;un canal d&#39;écoulement en forme de Y attaché à une seconde couche hébergeant micropuits. Les souches sont placés dans des micropuits distincts, et imagée dans exactement les mêmes conditions dynamiques. Nous démonstrate l&#39;utilisation du dispositif de mesure de la localisation des protéines réponses à des impulsions de changement de nutriments dans différentes souches de levure.

Pour démontrer la séparation entre les différentes souches nous imagée deux souches de levures distinctes dans les puits de rechange. Imagerie la pleine puits montre aucune fuite cellulaire entre les puits (figure 5a, b). Les deux souches ont le même facteur de transcription MSN2 marqués avec la YFP. Pour tester l&#39;effet simultané de manière dynamique l&#39;évolution des conditions, nous avons changé les débits dans les deux canaux d&#39;entrée, créant ainsi une étape de milieu sans glucose-, qui a a...

Nous présentons une méthode simple pour produire des dispositifs microfluidiques capables d&#39;appliquer les mêmes conditions dynamiques à plusieurs souches distinctes, sans avoir besoin d&#39;une salle blanche ou lithographie douce.

Un dispositif microfluidique pour l&#39;étude de plusieurs souches distinctes

L'étude des réponses cellulaires aux changements environnementaux pose de nombreux défis expérimentaux : les cellules doivent être imagées dans des conditions changeantes, souvent dans un...

L'objectif général de la méthode suivante est d'observer le comportement de cellules individuelles provenant de différentes souches de levures dans des conditions dynamiques identiques. Cela est réalisé en fabriquant un dispositif microfluidique à deux couches, où la couche inférieure contiendra séparément chacune des différentes souches, et la couche supérieure permettra d'appliquer les conditions d'écoulement dynamique dans une deuxième étape. Différentes souches de levures sont placées dans les puits, puis le dispositif est fermé, créant un canal unique contenant plusieurs souches séparées.Ensuite, nous observons les réponses cellulaires à des changements dynamiques du milieu. En contrôlant les débits aux deux entrées du canal en Y, les résultats montrent différentes souches soumises aux mêmes conditions dynamiques, sans contamination croisée entre les puits. Ce dispositif microfluidique présente plusieurs avantages clés par rapport aux autres systèmes existants. Il permet d'observer plusieurs souches distinctes sous les mêmes conditions dynamiques.Également, et surtout, il peut être fabriqué facilement dans n'importe quel laboratoire sans nécessiter d'équipement particulier. L'origine de cette méthode découle d'une discussion sur la manière de suivre les réponses de différents isolats sauvages d'East aux passages de privation. Commencez par dessiner ou imprimer le tracé souhaité des microcanaux à l'échelle.Ensuite, recouvrez une lame de verre de couches de ruban adhésif transparent. Pour obtenir la hauteur souhaitée du canal, placez le modèle de conception sur une surface plane et alignez la lame par-dessus le motif de conception. Découpez maintenant soigneusement le ruban adhésif sur la lame de verre selon le modèle. Retirez le ruban adhésif de toutes les régions de la lame de verre.Acceptez ceux-ci dans la disposition du microcanal. Placez la lame dans une étuve chauffante à 65 degrés Celsius pendant trois minutes. Ensuite, nettoyez délicatement avec de l'éthanol.Mélangez les composants de base et de durcissement du PDMS conformément aux recommandations du fabricant. Versez environ 30 millilitres du mélange de PDMS dans une boîte de Pétri jusqu'à une hauteur d'environ 0,5 centimètre. Dégazez le PDMS sous vide si nécessaire.Immergez la lame de verre dans le PDMS avec le ruban adhésif structuré orienté vers le haut. Placer le motif après le PDMS empêche la formation de bulles d'air entre la lame et le fond de la boîte. Durcissez pendant 48 heures à 65 degrés Celsius, en veillant à ce que la boîte soit horizontale à l'aide d'un niveau à bulle, dans une nouvelle boîte de Pétri de 90 millimètres. Versez trois millilitres de mélange de PDMS.Cette étape peut être réalisée sur un spin codeur si disponible. DGAs et polymérisation comme indiqué précédemment. Découpez maintenant délicatement la couche d'écoulement du dispositif microfluidique à la taille souhaitée à l'aide d'un poinçon biopsique.Créez des trous pour les entrées et sorties dans la couche d'écoulement. Découpez également une couche de puits de taille similaire à partir du deuxième plat de Pétri et placez-la sur un verre épais. Faites glisser le gabarit par-dessus la disposition du design.Ensuite, percer des puits en les alignant avec les microcanaux de la configuration à l'aide d'éthanol, nettoyer les deux couches de PDMS et une lame de verre, puis les faire sécher à l'air. Puis, traiter la lame de verre et la couche de PDMS des puits soit avec un graveur à plasma standard pour une liaison non réversible, soit avec un appareil à décharge coronale portatif pour une liaison réversible. Placer soigneusement la couche des puits au-dessus de la lame afin d'assurer l'adhésion.Éliminer délicatement toutes les bulles d'air. Préparer le milieu souhaité dans des seringues adaptées et les relier à un tube tigon passé dans une pompe à seringue. Pour l'imagerie cellulaire.Utilisez les forces. Rendez-vous à la phase souhaitée, vortexez soigneusement la culture et transférez 300 microlitres dans des tubes de microcentrifugation. Déposez délicatement un microlitre de con canna A dans chaque puits de la couche de puits en PDMS.Éliminer l'excès de conna A de chaque puits deux fois en pipetant délicatement de l'eau pendant que le con en A sèche. Laver les souches deux fois avec 300 microlitres de milieu SC dépourvu de glucose. Éliminer le glucose résiduel des parois cellulaires favorise une bonne adhérence au conval.Après vortexage, pipeter soigneusement environ 0,5 microlitre de la suspension cellulaire dans chaque puits individuel. Rincer doucement les cellules résiduelles avec du milieu riche. Les deux prochaines étapes doivent être réalisées rapidement afin d'éviter que les cellules ne s'assèchent.Étape facultative : traitez le chip et les puits en prenant soin de ne pas toucher directement les puits. Ensuite, sous un stéréomicroscope, placez délicatement le chip sur les puits en portant une attention particulière à l'alignement entre les deux. Appuyez doucement pour faire adhérer les deux couches de PDMS.Remplissez lentement complètement le dispositif avec environ 50 microlitres de milieu riche, en veillant à ce qu'aucune bulle d'air ne reste à l'intérieur du canal. Connectez maintenant le dispositif en insérant les tubes dans les entrées appropriées et démarrez l'écoulement du milieu. Veillez à ce qu'aucune bulle d'air ne se forme dans les tubulures, car celles-ci peuvent s'obstruer dans le dispositif et perturber l'écoulement.Procédez au placement du dispositif sous un microscope et repérez des points d'imagerie appropriés dans chacun. Maintenez les cellules sous un flux abondant de milieu pendant une heure ou plus, si nécessaire, afin de permettre la récupération.Démarrez l'expérience avec un débit constant. Réglez la pompe A à 0,8 millilitre par heure et la pompe B à 0,2 millilitre par heure. Pour un milieu s'écoulant sur 80 % de la largeur du canal.Nous pouvons modifier dynamiquement les conditions dans le dispositif en changeant les débits relatifs. Les nouvelles conditions se stabilisent en quelques secondes sur toute la longueur du canal. Pour démontrer la séparation entre différentes souches, deux souches de levure distinctes sont imagées dans des puits alternés.Remarquez qu'il n'y a pas de fuite cellulaire entre les puits lors de cette expérience. Les deux souches possèdent le facteur de transcription MSN deux marqué avec YFP afin de tester l'effet simultané de conditions changeant dynamiquement. Les débits dans les deux canaux d'entrée ont été modifiés pour créer un palier avec un milieu sans glucose.Cela a entraîné la localisation de MSN deux dans le noyau. Importamment, la courbe temporelle des niveaux de MSN deux-YFP nucléaire peut être analysée dans des cellules individuelles. Ainsi, le dispositif microfluidique en PDMS peut être utilisé pour appliquer simultanément des conditions dynamiques à plusieurs puits.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de ne pas laisser les cellules sécher pendant l'assemblage du dispositif. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée facilement sans nécessiter de lithographie douce.

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