Simple reconstruction microscopie électronique de particules du complexe Exosome Utilisation de la méthode aléatoire Tilt conique

L’objectif global de l’expérience suivante est d’obtenir la structure tridimensionnelle du complexe d’exosomes en utilisant la méthode de l’inclinaison conique aléatoire. Ceci est réalisé en déposant d’abord une fine couche de film de carbone sur la grille de carbone sacrée pour constituer le substrat de support du complexe protéique et de la coloration dans un deuxième temps. L’échantillon et la teinture sont appliqués sur la grille, qui enfouit l’échantillon dans des sels de métaux lourds.

La microscopie électronique est ensuite effectuée pour obtenir des paires de micrographies d’inclinaison de l’échantillon. Enfin, on obtient des résultats qui montrent la structure tridimensionnelle du complexe d’exosomes sur la base de l’analyse d’images à l’aide de la méthode de l’inclinaison conique aléatoire. En général, les personnes novices dans cette méthode auront du mal car il est parfois difficile de bien préparer l’échantillon pour la méthode d’inclinaison conique aléatoire, ainsi que la procédure de traitement de l’image qui suit View.

La démonstration de cette méthode est essentielle car les étapes de préparation du grade et de l’échantillon sont difficiles à apprendre sans une illustration de l’évaluation de l’échantillon. Le principe de la méthode de l’inclinaison conique aléatoire nécessite de prendre une paire de micrographies de la même région d’un échantillon à l’intérieur du microscope électronique. Une photo est prise de l’échantillon en position non inclinée, et l’autre photo est prise de l’échantillon incliné à un angle compris entre 50 et 70 degrés À l’aide de l’ordinateur, la paire de micrographies numérisées est placée côte à côte et les images des mêmes particules sont sélectionnées dans cette illustration.

Ces images sont marquées par des numéros en coordonnées tridimensionnelles. Les images des particules non inclinées et de leurs partenaires inclinés sont corrélées les unes aux autres par la direction de l’axe d’inclinaison et l’angle d’inclinaison. L’alignement des images de particules non inclinées amène les images des particules inclinées à leurs emplacements correspondants en tant qu’aMule à l’aide de plusieurs images de particules inclinées remplissant l’espace azimutal, la structure tridimensionnelle de la molécule peut être reconstruite à l’aide d’un algorithme de rétroprojection pour fabriquer les grilles d’abord, préparer une solution VAR à 0,5 % en ajoutant 0,45 gramme de résine formelle polyvinylique, et 90 millilitres de chloroforme dans un bécher en verre de 100 millilitres.

Dans une hotte, couvrez le bécher de papier d’aluminium et dissolvez la résine de forme var. Avec le huit d’un petit barreau d’agitation et d’un agitateur magnétique, la résine met environ 15 minutes à se dissoudre. Pendant ce temps, nettoyez les lames de verre de microscopie pré-nettoyées dans du méthanol et avec des lingettes Kim.

Une fois que la résine de forme var est complètement dissoute. Dans le chloroforme, ajoutez un millilitre de glycérol à 50 % à la surface de la solution. L’ajustement du volume de glycérol ajouté affecte la densité des trous dans le carbone sacré.

Versez la pointe d’un ultrason dans la solution. À environ un pouce de profondeur, utilisez la puissance maximale pour sonicer pendant une minute, ce qui fera une émulsion de gouttelettes de glycérol sous la forme de notre solution. Une sonication plus longue provoquera une taille plus petite de trous dans le carbone sacré.

La solution devient laiteuse après cette étape. Immédiatement après le trempage de sonication, le verre propre glisse verticalement dans l’émulsion. Pendant une seconde, retirez-les et épongez le bas des lames à l’aide de papier filtre pour former une fine pellicule plastique sur la surface des lames.

Une fois le chloroforme évaporé, vérifiez la densité et la taille des trous dans le film au microscope optique. La condition de préparation décrite ici doit produire 10 à 20 trous dans chaque carré d’une grille de 400 mailles d’un diamètre compris entre trois et quatre micromètres. Une fois que les lames de verre sont sèches, coupez le bord du film plastique sur la surface de la lame.

Faites flotter le film à la surface de l’eau distillée en plongeant verticalement la lame dans l’eau. La fine pellicule à la surface de l’eau peut être observée à un angle oblique contre la réflexion de la lumière. Placez des grilles de cuivre de 400 mailles sur le film, une par une, avec la surface lisse de la grille vers le bas.

Ramassez le film plastique avec des grilles à l’aide d’une feuille de papier. Retournez le papier et laissez-le sécher. Dans une boîte de Pétri, trempez le papier dans du méthanol pour éliminer le glycérol résiduel dans les trous et laissez le papier sécher à l’air.

À l’aide d’un évaporateur de carbone, recouvrir les grilles d’une couche de carbone d’une épaisseur d’environ 20 nanomètres. Utiliser le temps d’évaporation pour contrôler l’épaisseur souhaitée. L’épaisseur peut être déterminée par la couleur grise du carbone par rapport à la couleur grise d’une couche de carbone d’épaisseur connue.

Faites tremper les grilles en couches de carbone avec du chloroforme dans une boîte de Pétri en verre pendant une demi-heure pour éliminer la forme var forme var, suivie d’un séchage des grilles pour obtenir des grilles de carbone sacrées faites maison. Ensuite, évaporez une fine couche de carbone d’environ cinq nanomètres d’épaisseur sur une surface de mica fraîchement clivée. Ensuite, placez soigneusement les grilles de carbone sacrées sur un morceau de papier filtre sous de l’eau distillée.

Dans un appareil fait maison, faites flotter le carbone mince de la surface du mica sur la surface de l’eau et déposez-le lentement sur les grilles de carbone sacrées. Prenez le papier filtre avec des grilles dessus et laissez-le sécher. Dans une hotte, commencez la coloration négative du complexe d’exosomes en préparant une solution fraîche de formiate d’urinoir à 2 %.

Comme décrit dans la procédure écrite, couvrez le tube de solution avec un morceau de papier d’aluminium Pour éviter l’exposition à la lumière, la solution doit être utilisée de la même manière. La lueur diurne décharge un mince carbone sur une grille entièrement en carbone à l’aide d’un appareil à décharge lumineuse. Ensuite, placez un morceau de parfum propre sur la pipette de paillasse trois gouttelettes de 50 microlitres de solution de coloration de formiate d’urinoir sur le perfil, diluez le complexe d’exosomes à une concentration d’environ 50 nanomolaires à l’aide d’une pipette tampon de dilution de quatre microlitres de la protéine diluée jusqu’à ce que la grille de lueur se décharge.

Laissez l’échantillon rester sur la grille pendant une minute, puis épongez la solution résiduelle avec un morceau de papier filtre à l’aide d’une pince à épiler. Retournez la grille immédiatement sur la première gouttelette de tache et rincez la grille en la déplaçant plusieurs fois d’avant en arrière pendant environ 10 secondes. Répétez ce processus pour chacune des trois gouttelettes de teinture après le dernier rinçage, laissez la tache rester sur la grille pendant une minute supplémentaire.

Ensuite, épongez la tache avec un morceau de papier filtre. Gardez une fine couche de solution de teinture sur la surface de la grille et laissez la grille sécher dans une hotte. Placez la grille d’échantillonnage dans le porte-échantillon, puis placez-le dans un microscope électronique FEI TE nine 12.

Vérifiez la grille d’échantillons à faible grossissement pour trouver les meilleurs carrés tachés. Un bon carré semble avoir une douzaine de trous d’environ un à deux micromètres et des zones sombres. Activez le mode basse dose de l’interface utilisateur FEI et alignez le focus de recherche et la position d’exposition en mode faible dose.

Réglez la recherche en mode fraction avec une longueur de caméra de 1,5 mètre. Réglez la mise au point sur un grossissement de 150 K et réglez l’exposition sur un grossissement de 50 K avec un temps d’exposition mesuré d’une seconde. Normalement, une caractéristique reconnaissable sur la grille en mode de recherche et d’exposition est utilisée pour effectuer l’alignement.

Trouvez les trous avec une bonne coloration en mode recherche et enregistrez les emplacements. Prenez une photo CCD du carré. Inclinez l’échantillon à 55 degrés et prenez une autre photo.

Comparez les deux images et identifiez les trous appariés dans les deux micrographies. Inclinez la scène à zéro degré. Utilisez le kit à faible dose pour prendre des photos de chaque trou identifié en mode recherche à fort grossissement avec une défocalisation d’environ moins 0,7 micromètre.

Une fois que vous avez pris des photos de tous les trous, inclinez la scène à 55 degrés en utilisant le même grossissement. Prenez des micrographies de l’échantillon incliné avec une défocalisation d’environ moins 1,2 micromètre. Identifiez la paire de micrographies d’inclinaison correspondante en fonction des motifs des micrographies à faible grossissement en utilisant le motif irrégulier des grilles de carbone sacré faites maison.

Pour aider à la corrélation, choisissez des paires d’inclinaison micrographique avec des particules de distribution uniforme et sans halos autour des particules. Les micrographies avec des halos de taches évidents autour d’elles doivent être jetées pour traiter les données. Démarrez avec la configuration du programme dans la procédure.

Le traitement d’images sera démontré à l’aide du processus 2D dans le package Eman. Pour changer le format de l’image, le package iMagic five pour faire l’alignement 2D et le package spider. Pour effectuer la reconstruction et le raffinement 3D, convertissez l’image numérique DM three Gatan au format d’image d’araignée.

À l’aide de la commande process 2D, sélectionnez les paires de particules. À l’aide du programme web distribué dans le paquet de programmes d’araignée, le programme enregistre automatiquement les coordonnées de la boîte de particules de toutes les particules sélectionnées à l’aide du script d’araignée. Le script enregistre les piles de particules inclinées et non inclinées.

Convertissez les particules inclinées UN au format IMAG cinq. À l’aide du programme EM deux EM, filtrez et masquez les particules inclinées UN à l’aide de la commande de préparation InCorp dans IMAG cinq et centrez les particules masquées passe-bande à l’aide de la commande centre. Dans imag five, alignez et classez les particules de manière itérative en classes homogènes à l’aide d’un script batch exécutant automatiquement les programmes IMAG five.

Ensuite, utilisez la commande MSA names in class dans IMAG five pour générer la table de recherche des particules d’une classe, générez un fichier de tracé pour la translation et les valeurs de rotation de l’alignement pour chaque particule à l’aide de la commande header. Dans iMagic five, convertissez les particules alignées au format araignée à l’aide du programme EM two EM. Transformez ensuite la table de recherche des classes en fichiers de document en araignée.

Les valeurs de translation et de rotation de l’alignement pour chaque particule sont également converties dans un fichier de document d’araignée, un filtre passe-bande, masquez et centrez les particules inclinées, tout comme pour les particules non inclinées dans IMAG cinq, générez un nouvel ensemble de données pour les particules inclinées centrales. Créez des fichiers de documents angulaires à partir des documents d’alignement multi-références générés par IMAG five et des fichiers DCB générés par le programme Web. Utilisez le script de rétroprojection dans spider pour obtenir un modèle initial pour chaque moyenne de classe.

Enfin, effectuez un raffinement de projection du volume initial à l’aide du script d’araignée contre toutes les particules non inclinées pour obtenir le volume final à l’aide de RCT. Environ 50 reconstructions de l’exosome ont été obtenues. Les volumes sont générés à partir de particules inclinées correspondant à chaque particule dans les 50 classes de particules non inclinées.

En utilisant la rétroprojection implémentée dans le package spider, le raffinement de correspondance de projection a ensuite été effectué En utilisant ces volumes comme modèles initiaux et le volume 3D affiché de l’exosome a été généré à une résolution supplémentaire d’environ 18 ang, nous pouvons ensuite esquiver les modèles atomiques des différentes parties du complexe dans la carte 3D. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser l’ECR pour obtenir des reconstructions tridimensionnelles, de la génération d’une bonne grille narrative debout d’échantillon aux micrographies peer-to-peer, et enfin à l’obtention de la reconstruction à l’aide de techniques d’analyse d’images. Outre le protocole que nous avons décrit ici, il existe plusieurs méthodes pour obtenir les reconstructions finales en analyse d’images.

L’étape la plus critique pour obtenir une reconstruction fiable et correcte est de travailler avec un échantillon bien préparé.