Simple reconstruction microscopie électronique de particules du complexe Exosome Utilisation de la méthode aléatoire Tilt conique

L'objectif général de l'expérience suivante est d'obtenir la structure tridimensionnelle du complexe de l'exosome en utilisant la méthode de basculement conique aléatoire. Cela est réalisé en déposant d'abord une fine couche de film de carbone sur la grille de carbone perforée afin de constituer le substrat de support pour le complexe protéique, puis en appliquant la coloration comme deuxième étape. L'échantillon et la coloration sont déposés sur la grille, ce qui enfouit l'échantillon dans des sels de métaux lourds.

La microscopie électronique est ensuite réalisée afin d'obtenir des paires de micrographies inclinées de l'échantillon. Enfin, des résultats sont obtenus, montrant la structure tridimensionnelle du complexe des exosomes, basée sur une analyse d'images à l'aide de la méthode d'inclinaison conique aléatoire. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car la préparation adéquate de l'échantillon pour la méthode d'inclinaison conique aléatoire peut s'avérer délicate, tout comme la procédure de traitement d'images qui suit View.

La démonstration de cette méthode est essentielle, car les étapes d'évaluation et de préparation de l'échantillon sont difficiles à apprendre sans illustration de l'analyse de l'échantillon. Le principe de la méthode de basculement conique aléatoire consiste à acquérir une paire de microphotographies de la même région d'un échantillon dans le microscope électronique. Une image est prise avec l'échantillon en position non inclinée, et l'autre image est prise avec l'échantillon incliné d'un angle compris entre 50 et 70 degrés. À l'aide de l'ordinateur, la paire de microphotographies numérisées est placée côte à côte, et les images provenant des mêmes particules sont sélectionnées dans cette illustration.

Ces images sont marquées par des numéros en coordonnées tridimensionnelles. Les images des particules non inclinées et celles de leurs homologues inclinées sont corrélées entre elles par la direction de l'axe d'inclinaison et l'angle d'inclinaison. L'alignement des images des particules non inclinées amène les images des particules inclinées à leurs emplacements correspondants en tant que positions aMule ; à l'aide de multiples images de particules inclinées remplissant l'espace azimutal, la structure tridimensionnelle de la molécule peut être reconstruite à l'aide d'un algorithme de rétroprojection. Pour fabriquer les grilles en premier lieu, préparez une solution de form VAR à 0,5 % en ajoutant 0,45 gramme de résine de polyvinylformaldéhyde et 90 millilitres de chloroforme à un bécher en verre de 100 millilitres.

Dans une hotte, recouvrez le bécher de papier d’aluminium et dissolvez la résine de formvar. À l’aide d’un petit barreau d’agitation et d’un agitateur magnétique, la résine met environ 15 minutes à se dissoudre. Pendant ce temps, nettoyez les lames de microscopie préalablement nettoyées avec du méthanol et des lingettes Kim.

Une fois que la résine de formvar est complètement dissoute dans le chloroforme, ajoutez un millilitre de glycérol à 50 % à la surface de la solution. Le volume de glycérol ajouté modifie la densité des trous dans le carbone percé.

Inclinez la pointe d'un ultrasonique dans la solution. À une profondeur d'environ un pouce, utilisez la puissance maximale pour soniquer pendant une minute, ce qui produira une émulsion de gouttelettes de glycérol sous la forme de notre solution. Une sonication plus longue entraînera une réduction de la taille des trous dans le carbone troué.

La solution devient laiteuse après cette étape. Immédiatement après l'immersion en sonication, plonger verticalement les lames de verre propres dans l'émulsion. Les retirer pendant une seconde et essuyer le bas des lames à l'aide de papier filtre afin de former un film plastique fin à la surface des lames.

Après évaporation du chloroforme, vérifiez la densité et la taille des trous dans le film au microscope optique. Les conditions de préparation décrites ici doivent produire de 10 à 20 trous par carré d'une grille de 400 mailles, avec des diamètres compris entre trois et quatre micromètres. Une fois que les lames de verre sont sèches, découpez le bord du film plastique à la surface de la lame.

Faites flotter le film à la surface de l'eau distillée en plongeant verticalement la lame dans l'eau. Le film mince à la surface de l'eau peut être observé selon un angle rasante en regardant contre la réflexion de la lumière. Placez des grilles en cuivre de 400 mailles sur le film, une par une, avec la surface lisse de la grille orientée vers le bas.

Prenez le film plastique avec les grilles à l’aide d’un morceau de papier. Retournez le papier et laissez-le sécher. Dans une boîte de Pétri, imbibez le papier de méthanol pour éliminer le glycérol résiduel présent dans les trous, puis laissez le papier sécher à l’air libre.

Utilisez un évaporateur de carbone pour recouvrir les grilles d'une couche de carbone d'une épaisseur d'environ 20 nanomètres. Utilisez le temps d'évaporation pour contrôler l'épaisseur souhaitée. L'épaisseur peut être déterminée par la couleur grise du carbone, comparée à la couleur grise d'une couche de carbone d'épaisseur connue.

Imbiber les grilles à couche de carbone avec du chloroforme dans une boîte de Pétri en verre pendant une demi-heure pour éliminer le vernis de formvar, puis faire sécher les grilles afin d'obtenir des grilles de carbone percées maison. Ensuite, déposer par évaporation une fine couche de carbone d'environ cinq nanomètres d'épaisseur sur une surface fraîchement clivée de mica. Puis placer délicatement les grilles de carbone percées sur un morceau de papier filtre placé sous de l'eau distillée.

Dans un appareil maison, faites flotter le carbone mince provenant de la surface de la mica à la surface de l'eau et déposez-le lentement sur les grilles de carbone perforées. Prenez le papier filtre avec les grilles et laissez-le sécher. Dans une hotte, commencez la coloration négative du complexe d'exosomes en préparant une solution fraîche de formiate d'urane à 2 %.

Comme décrit dans le protocole écrit, couvrez le tube contenant la solution avec un morceau de papier d’aluminium afin d’éviter toute exposition à la lumière ; la solution doit être utilisée le jour même. Effectuez une décharge lumineuse sur une grille entièrement en carbone recouverte d’une fine couche de carbone à l’aide d’un appareil à décharge lumineuse. Ensuite, placez un morceau de parafilm propre sur la paillasse et déposez à l’aide d’une pipette trois gouttelettes de 50 microlitres de solution de colorant au formiate d’urane sur le parafilm. Diluez le complexe d’exosomes à une concentration d’environ 50 nanomolaires à l’aide du tampon de dilution, puis pipetez quatre microlitres de la protéine diluée sur la grille ayant subi la décharge lumineuse.

Laisser l'échantillon sur la grille pendant une minute, puis éliminer la solution résiduelle à l'aide d'un morceau de papier filtre à l'aide de pinces. Retourner immédiatement la grille au-dessus de la première goutte de colorant et rincer la grille en la déplaçant plusieurs fois d'avant en arrière pendant environ 10 secondes. Répéter ce processus pour chacune des trois gouttes de colorant ; après le dernier rinçage, laisser le colorant agir sur la grille pendant une minute supplémentaire.

Ensuite, éliminez la coloration à l'aide d'un morceau de papier filtre. Maintenez une fine couche de solution de coloration à la surface de la grille et laissez sécher la grille dans une hotte aspirante. Placez la grille d'échantillon dans le porte-échantillon, puis insérez le porte-échantillon dans un microscope électronique FEI TE nine 12.

Vérifiez la grille d'échantillon à faible grossissement pour trouver les carrés les mieux colorés. Un bon carré semble présenter une douzaine de trous d'une dimension d'environ un à deux micromètres, avec des zones fortement colorées à l'intérieur. Activez le mode faible dose de l'interface utilisateur FEI et alignez le point de focalisation de recherche et la position d'exposition en mode faible dose.

Régler la recherche en mode fraction avec une longueur de caméra de 1,5 mètre. Régler la mise au point sur un grossissement de 150 K et régler l'exposition sur un grossissement de 50 K avec un temps d'exposition mesuré d'une seconde. En général, une caractéristique reconnaissable sur la grille, visible en mode recherche et en mode exposition, est utilisée pour effectuer l'alignement.

Recherchez les trous présentant une bonne coloration en mode recherche et enregistrez leurs positions. Prenez une image CCD du carré. Inclinez l'échantillon à 55 degrés et prenez une autre image.

Comparez les deux images et identifiez les trous appariés sur les deux micrographies. Inclinez à nouveau le porte-objet à zéro degré. Utilisez le kit à faible dose pour prendre des images de chaque trou identifié en mode recherche, en fort grossissement et avec un défocalage d'environ moins 0,7 micromètre.

Après avoir pris des images de tous les trous, inclinez la platine à 55 degrés en utilisant le même grossissement. Prenez des micrographies de l'échantillon incliné avec un défocalage d'environ moins 1,2 micromètre. Identifiez la paire de micrographies correspondante selon l'inclinaison en vous basant sur les motifs visibles dans les micrographies à faible grossissement, en utilisant le motif irrégulier des grilles en carbone percées maison.

Pour aider la corrélation, choisissez des paires de micrographies inclinées présentant une distribution uniforme des particules et sans halos autour des particules. Les micrographies présentant des halos de coloration évidents autour des particules doivent être écartées pour le traitement des données. Commencez par la configuration du programme dans la procédure.

Le traitement d'images sera démontré en utilisant le processus 2D dans le paquet Eman. Pour changer le format d'image, utilisez le paquet iMagic five afin d'effectuer l'alignement 2D et le paquet spider. Pour réaliser la reconstruction et le raffinement 3D, convertissez l'image numérique DM3 du système Gatan au format d'image spider.

À l'aide de la commande processus 2D, sélectionnez les paires de particules. En utilisant le programme en ligne distribué dans le package du programme spider, le programme enregistre automatiquement les coordonnées des particules encadrées et extrait toutes les particules sélectionnées à l'aide du script spider. Le script enregistre les jeux de données de particules inclinées et non inclinées.

Convertir les particules inclinées UN au format IMAG cinq. À l'aide du programme EM deux EM et de la bande passante, filtrer et masquer les particules inclinées UN à l'aide de la commande InCorp prep dans IMAG cinq, puis centrer les particules masquées par bande passante à l'aide de la commande center. Dans IMAG cinq, aligner et classer itérativement les particules en classes homogènes à l'aide d'un script par lot exécutant automatiquement les programmes IMAG cinq.

Ensuite, utilisez les noms MSA dans la commande class d’IMAG cinq pour générer la table de correspondance des particules de la classe, puis générez un fichier de tracé contenant les valeurs de translation et de rotation de l'alignement pour chaque particule à l'aide de la commande header. Dans iMagic cinq, convertissez les particules alignées au format spider en utilisant le programme EM deux EM. Puis, transformez la table de correspondance des classes en fichiers documents spider.

Les valeurs de translation et de rotation de l'alignement pour chaque particule sont également converties en un fichier de type spider, puis filtrées par bande passante, masquées et centrées, exactement comme pour les particules non inclinées dans IMAG cinq, afin de générer un nouveau jeu de données pour les particules inclinées centrées. Créer des fichiers angulaires à partir des documents d'alignement multi-références obtenus avec IMAG cinq et des fichiers DCB générés par le programme en ligne. Utiliser le script de rétroprojection dans spider pour obtenir un modèle initial pour chaque moyenne de classe.

Enfin, effectuez un affinement par projection du volume initial à l'aide du script spider sur toutes les particules non inclinées afin d'obtenir le volume final par RCT. Environ 50 reconstructions de l'exosome ont été obtenues. Les volumes sont générés à partir des particules inclinées correspondant à chaque particule dans les 50 classes de particules non inclinées.

À l'aide de la rétroprojection mise en œuvre dans le package spider, l'affinement par apparie des projections a ensuite été effectué en utilisant ces volumes comme modèles initiaux, et le volume tridimensionnel affiché de l'exosome a été généré à une résolution d'environ 18 angströms. Nous pouvons alors intégrer les modèles atomiques des différentes parties du complexe dans la carte tridimensionnelle. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser la RCT pour obtenir des reconstructions tridimensionnelles, depuis la préparation d'une grille adéquate d'échantillons jusqu'à l'acquisition de micrographies en transmission, et enfin l'obtention de la reconstruction par des techniques d'analyse d'image. Outre le protocole que nous avons décrit ici, plusieurs méthodes permettent d'obtenir les reconstructions finales en analyse d'image.

La étape la plus critique pour obtenir une reconstruction fiable et correcte consiste à travailler avec un spécimen bien préparé.