Name: Simple reconstruction microscopie électronique de particules du complexe Exosome Utilisation de la méthode aléatoire Tilt conique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Apprenez la reconstruction 3D du complexe exosome de Saccharomyces cerevisiae par microscopie électronique à coloration négative. Cette méthode RCT permet d'obtenir des structures macromoléculaires à résolution moyenne.

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Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire à Nogales UC-Berkeley en aidant à établir des protocoles initiaux et les membres de Wang laboratoire à l&#39;Université de Yale dans leur aider à établir les protocoles plein. Nous reconnaissons aussi le personnel en cryo-EM installations et centre de calcul haute performance à l&#39;école de médecine de Yale pour leur soutien. HW Smith est une famille de boursiers.

<ol><li>van Heel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angular+reconstitution%3A+a+posteriori+assignment+of+projection+directions+for+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction.</a> Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).</li>
<li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+single+particles+from+random+and+nonrandom+tilt+series%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc+Tech%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of single particles from random and nonrandom tilt series.</a> J Electron Microsc Tech. 9, 359-394 (1988).</li>
<li>Penczek, P. A., Grassucci, R. A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+at+improved+resolution%3A+new+techniques+for+merging+and+orientation+refinement+in+3D+cryo-electron+microscopy+of+biological+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">The ribosome at improved resolution: new techniques for merging and orientation refinement in 3D cryo-electron microscopy of biological particles.</a> Ultramicroscopy. 53, 251-270 (1994).</li>
<li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+and+image+classification+-+powerful+tools+in+modern+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Negative staining and image classification - powerful tools in modern electron microscopy.</a> Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).</li>
<li>Frank, J., Radermacher, M., Penczek, P., Zhu, J., Li, Y., Ladjadj, M., Leith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+and+WEB%3A+processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).</li>
<li>Shaikh, T. R., Gao, H., Baxter, W. T., Asturias, F. J., Boisset, N., Leith, A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+image+processing+for+single+particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">SPIDER image processing for single particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nat Protoc. 3, 1941-1974 (2008).</li>
<li>Heel, M. van, Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> J Struct Biol. 116, 17-24 (1996).</li>
<li>Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN%3A+semiautomated+software+for+high-resolution+single-particle+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions.</a> J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).</li>
<li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comput+Chem%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).</li>
<li>Wang, H. W., Wang, J., Ding, F., Callahan, K., Bratkowski, M. A., Buttler, J. S., Nogales, E., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+yeast+Rrp44+exosome+complex+suggests+routes+of+RNA+recruitment+for+3%27+end+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Architecture of the yeast Rrp44 exosome complex suggests routes of RNA recruitment for 3' end processing.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16844-16849 (2007).</li>
<li>Scheres, S. H., Nunez-Ramirez, R., Sorzano, C. O., Carazo, J. M., Marabini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+for+electron+microscopy+single-particle+analysis+using+Xmipp%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Image processing for electron microscopy single-particle analysis using Xmipp.</a> Nat Protoc. 3, 977-990 (2008).</li>
<li>Yoshioka, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Potter, C. S., Milligan, R. A., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+of+random+conical+tilt+and+orthogonal+tilt+data+collection+using+feature-based+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Automation of random conical tilt and orthogonal tilt data collection using feature-based correlation.</a> J Struct Biol. 159, 335-346 (2007).</li>
</ol>

Dans cet article nous présentons un protocole détaillé de préparation des échantillons et les trois dimensions de reconstruction du complexe exosomes utilisant la microscopie électronique négative coloration. En utilisant cette méthode, nous avons obtenu la reconstruction 3D utilisant la méthode aléatoire d&#39;inclinaison conique sans aucune connaissance préalable de la structure. Aléatoire la méthode d&#39;inclinaison conique n&#39;est pas nécessairement un échantillon homogène, mais l&#39;étape de projection suivante...

<table><tbody><tr><td>Résine de formaldéhyde de polyvinyle</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63450-15-7</td><td></td></tr><tr><td>Formiate d'uranyle</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22451</td><td></td></tr><tr><td>Lames microscopiques Superfrost</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>4951F-001</td><td></td></tr><tr><td>Grille régulière de 400 mesh</td><td>SPI Supplies</td><td>3040C</td><td></td></tr><tr><td>Revêtement de carbone Auto 306</td><td>Edwards Lifesciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope électronique Tecnai-12</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispositif d'ionisation par effet Corona</td><td>BAL-TEC</td><td></td><td>Poste de pulvérisation cathodique SCD 005</td></tr></tbody></table>

simple reconstruction microscopie électronique de particules du complexe exosome utilisation de la méthode aléatoire tilt conique

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Simple microscopie électronique de particules (EM) la reconstruction est récemment devenu un outil populaire pour obtenir les trois dimensions (3D) la structure des complexes macromoléculaires grande. Comparé à cristallographie aux rayons X, il a quelques avantages uniques. Tout d&#39;abord, seule la reconstruction de particules EM n&#39;a pas besoin de cristalliser l&#39;échantillon de protéine, qui est le goulot d&#39;étranglement dans cristallographie aux rayons X, notamment pour les grands complexes macromoléculaires. Deuxièmement, il n&#39;a pas besoin de grandes quantités d&#39;échantillons de protéines. Comparativement aux milligrammes de protéines nécessaires à la cristallisation, la seule particule EM besoins de reconstruction que plusieurs micro-litres de solution de protéine à la nano-concentrations molaires, en utilisant la méthode de coloration négative EM. Cependant, malgré un peu d&#39;assemblages macromoléculaires à symétrie élevée, seule particule EM est limité à une résolution relativement faible (inférieure à une résolution de 1 nm) pour de nombreux spécimens en particulier ceux sans symétrie. Cette technique est également limitée par la taille des molécules à l&#39;étude, soit 100 kDa pour les spécimens colorés négativement et 300 kDa pour frozen-hydraté spécimens en général. Pour un nouvel échantillon de structure inconnue, on utilise généralement une solution de métal lourd à intégrer les molécules par coloration négative. L&#39;échantillon est ensuite examiné au microscope électronique à transmission à prendre en deux dimensions (2D) micrographies des molécules. Idéalement, les molécules de protéines ont une structure homogène 3D mais présentent des orientations différentes dans les micrographies. Ces micrographies sont numérisées et traitées dans les ordinateurs comme des «particules uniques&quot;. En utilisant deux dimensions d&#39;alignement et les techniques de classification, les molécules homogènes dans les mêmes vues sont regroupées en classes. Leurs moyennes améliorer le signal de formes 2D de la molécule. Après nous assignons les particules dans le bon sens relatif (angles d&#39;Euler), nous serons en mesure de reconstruire les images 2D de particules dans un volume virtuel en 3D. Dans la reconstruction de particules 3D unique, une étape essentielle est d&#39;assigner correctement l&#39;orientation correcte de chaque particule unique. Il existe plusieurs méthodes pour attribuer le point de vue pour chaque particule, dont la reconstitution angulaire 1 et aléatoire d&#39;inclinaison conique (ECR) la méthode 2. Dans ce protocole, nous décrivons notre pratique à obtenir la reconstruction 3D du complexe de la levure à l&#39;aide exosomes coloration négative EM et ECR. Il convient de noter que notre protocole de la microscopie électronique et de traitement de l&#39;image suit le principe de base du RCT, mais n&#39;est pas la seule façon d&#39;exécuter la méthode. Nous décrivons d&#39;abord comment intégrer l&#39;échantillon de protéine dans une couche d&#39;uranyle-Formiate d&#39;une épaisseur comparable à la taille des protéines, en utilisant une grille de carbone troué recouvert d&#39;une couche de film continu de carbone mince. Puis l&#39;échantillon est inséré dans un microscope électronique à transmission à recueillir Untilted (0 degré) et incliné (55 degrés) paires de micrographies qui sera utilisé plus tard pour le traitement et l&#39;obtention d&#39;un premier modèle 3D de la exosomes levure. À cette fin, nous effectuons RCT et ensuite raffiner le modèle initial en 3D en utilisant la projection correspondant 3 la méthode de raffinement.

Cet article décrit une méthode standard pour obtenir un en trois dimensions (3D) la reconstruction des macromolécules biologiques en utilisant la microscopie électronique négative coloration (EM). Dans ce protocole, nous expliquons comment obtenir la structure 3D du complexe Saccharomyces cerevisiae exosomes à moyenne résolution utilisant la méthode aléatoire coniques de reconstruction d&#39;inclinaison (ECR).

Simple reconstruction microscopie électronique de particules du complexe Exosome Utilisation de la méthode aléatoire Tilt conique

La reconstruction par microscopie électronique (ME) de particule unique est récemment devenue un outil populaire pour obtenir la structure tridimensionnelle (3D) de grands...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'obtenir la structure tridimensionnelle du complexe de l'exosome en utilisant la méthode de basculement conique aléatoire. Cela est réalisé en déposant d'abord une fine couche de film de carbone sur la grille de carbone perforée afin de constituer le substrat de support pour le complexe protéique, puis en appliquant la coloration comme deuxième étape. L'échantillon et la coloration sont déposés sur la grille, ce qui enfouit l'échantillon dans des sels de métaux lourds.La microscopie électronique est ensuite réalisée afin d'obtenir des paires de micrographies inclinées de l'échantillon. Enfin, des résultats sont obtenus, montrant la structure tridimensionnelle du complexe des exosomes, basée sur une analyse d'images à l'aide de la méthode d'inclinaison conique aléatoire. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car la préparation adéquate de l'échantillon pour la méthode d'inclinaison conique aléatoire peut s'avérer délicate, tout comme la procédure de traitement d'images qui suit View.La démonstration de cette méthode est essentielle, car les étapes d'évaluation et de préparation de l'échantil

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L&#39;isolement et le profilage des exosomes de Bile humain contenant microARN-

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Apprenez la reconstruction 3D du complexe exosome de Saccharomyces cerevisiae par microscopie électronique à coloration négative. Cette méthode RCT permet d'obtenir des structures macromoléculaires à résolution moyenne.

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