Méthodes in vitro ascendantes pour tester l’organisation ultrastructurale, le remodelage de la membrane et le comportement de sensibilité à la courbure des septines

À l’aide de ce protocole, nous avons visualisé l’organisation des protéines filamenteuses du cytosquelette sur des substrats de motifs présentant diverses courbures. Nous pouvons tester la sensibilité à la courbure. La résolution des images au microscope électronique à balayage est suffisamment élevée pour que les organisations à l’échelle nanométrique soient visualisées.

Les méthodes que nous utilisons pour la fixation sont suffisamment douces pour préserver l’organisation intra-structurelle de la protéine. Cela reste dans le cadre de la recherche fondamentale pour comprendre le comportement des filaments cytosquelettiques. Commencez par concevoir un adhésif optique Norland ondulé, ou réplique NOA, dans un environnement de salle blanche à partir de motifs ondulés en polydiméthylsiloxane ondulé ondulés de 250 nanomètres d’amplitude et de deux micromètres de périodicité latérale.

Pour ce faire, déposez cinq microlitres de NOA liquide sur un couvercle circulaire en verre d’un centimètre de diamètre, puis placez le gabarit PDMS sur la goutte. Traiter l’ensemble avec une lumière UV à 320 nanomètres pendant cinq minutes pour photopolymériser le NOA liquide en un film polymère mince. Une fois cela fait, retirez délicatement le gabarit PDMS du couvercle avec le NOA fraîchement polymérisé.

Traiter le film NOA à l’aide d’un purificateur plasma d’air pendant cinq minutes pour rendre la surface hydrophile. Préparer une solution de petites vésicules unilamellaires, ou VUS, comme décrit dans le manuscrit, et obtenir les VUS en remettant en suspension un film lipidique séché dans le tampon d’observation sous la sonication dans un sonicateur de bain pendant cinq à 10 minutes jusqu’à ce que la solution soit transparente. Plus tard, insérez les bordereaux de couvercle soutenant les modèles de NOA dans les puits des boîtes de culture cellulaire et incuber les modèles NOA fraîchement déchargés avec 100 microlitres d’une solution SUV d’un milligramme par millilitre pendant 30 minutes à température ambiante pour générer une bicouche lipidique soutenue.

Pour retirer le VUS non fusionné, rincez soigneusement les côtés six fois avec le tampon septine à faible teneur en sel sans laisser l’échantillon sécher complètement entre deux lavages. Diluer la solution mère de septine octocuma dans un tampon de septine à faible teneur en sel jusqu’à des concentrations finales, allant de 10 à 100 nanomolaires et des volumes d’un millilitre. Ensuite, incuber la solution protéique sur les lames pendant une heure à température ambiante.

Lavez les lames d’ANO contenant des bicouches lipidiques supportées fusionnées et incuber les protéines avec un tampon de septine à faible teneur en sel. Remplacer le tampon septine à faible teneur en sel par une solution fixatrice de glutaraldéhyde à 2% dans un tampon cacodylate de sodium 0,1 molaire, préchauffé à 37 degrés Celsius, et laisser la réaction se dérouler pendant 15 minutes, et laver l’échantillon fixe trois fois, cinq minutes chacun avec 0,1 molaire de cacodylate de sodium. Après lavage, incuber l’échantillon dans la solution fixatrice de tétroxyde d’osmium, puis l’acide tannique filtré, et enfin l’acétate d’uranyle filtré pendant 10 minutes chacun.

Lavez l’échantillon trois fois dans de l’eau distillée après chaque solution. Incuber l’échantillon en série dans des solutions d’éthanol à partir de 50% à 100% pendant deux à trois minutes chacune. Transférez les lames de verre à l’intérieur du sécheur à point critique prérempli d’éthanol et suivez les instructions du fabricant pour le séchage.

Comme les échantillons séchés sont très hydroscopiques, enduisez-les immédiatement en attachant le couvercle aux talons. Ajoutez ensuite une bande de peinture argentée sur la face supérieure du couvercle sans créer de déglomérats de peinture. Assurez-vous que la connexion avec le talon est satisfaisante.

Lorsque l’échantillon s’évapore complètement, utiliser un appareil équipé d’une tête de pulvérisation cathodique à plasma magnétron et d’un étage planétaire rotatif, et suivre les protocoles standard fournis par le fabricant. Effectuer une pré-pulvérisation cathodique à 120 milliampères pendant 60 secondes pour enlever la couche d’oxyde à la surface. Déposez ensuite 1,5 nanomètre de tungstène avec un moniteur d’épaisseur de film à 90 milliampères et une distance de travail de 50 millilitres.

Plus tard, stockez les échantillons sous vide pour les protéger de l’air ambiant jusqu’à et tout au long des analyses SEM. Pour obtenir une imagerie de solution élevée en détectant les électrons secondaires avec le détecteur intérieur, réglez la tension d’accélération à trois kilovolts et le courant du faisceau à une ouverture de 20 micromètres. Pour les observations, utilisez des résolutions allant de 21,25 nanomètres par pixel à 1,224 nanomètres par pixel.

Utilisez une résolution de 5,58 nanomètres par pixel pour l’analyse des données. Réglez la distance de travail entre un et deux millimètres pour une observation à haute résolution et environ trois millimètres si une profondeur de champ accrue est nécessaire. Ajustez la vitesse de numérisation et l’intégration de la ligne en continu pour garantir un rapport signal sur bruit constant avec un temps d’acquisition d’environ 30 à 45 secondes par image.

L’analyse représentative illustre l’effet du matériau déposé sur les filaments de septine sur des motifs PDMS ondulés avec 1,5 nanomètre de platine et 1,5 nanomètre de tungstène. Il a été observé que les vésicules unilamellaires géantes nues, ou GUV, étaient parfaitement sphériques. Après la déformation induite par la septine, les vésicules sont apparues facettées et les déformations sont restées statiques, et n’ont donc pas fluctué.

À des concentrations plus élevées de septines, des déformations périodiques des vésicules ont été observées. L’auto-assemblage des filaments de septine liés à de grandes vésicules unilamellaires, ou LUV, a été examiné avec une image de cryomicroscopie électronique et la reconstruction 3D a été obtenue à partir d’une série inclinée. L’arrangement dépendant de la courbure des filaments de septine a été visualisé par microscopie électronique à balayage.

À faible grossissement, un motif ondulé avec la périodicité des courbures négatives et positives était visible. L’organisation ultra-structurale des filaments de septine a été vue à un grossissement plus élevé. Le NOA doit être délicatement décollé pour éviter la dégradation.

Après l’imagerie, une analyse d’image peut être effectuée pour quantifier les caractéristiques d’ultrastructure visualisées par SCM, telles que l’espacement du filament et l’orientation du filament. La méthode actuelle a été appliquée aux septines, mais elle pourrait également être utilisée pour d’autres protéines du cytosquelette ou des protéines qui s’organisent en longs filaments et sont donc sensibles à la courbure.