Sectionnement, coloration et imagerie TEM d’exosomes intégrés : un protocole pour visualiser les caractéristiques structurelles des exosomes à l’aide de la TEM
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0 vues • 2:32 min • April 30th, 2023
Les exosomes sont des vésicules sphériques de taille nanométrique entourées d’une bicouche lipidique contenant des molécules d’ADN, d’ARN et de protéines présentes à l’intérieur de la lumière.
Pour visualiser la structure de l’exosome à l’aide de la microscopie électronique à transmission, ou MET, commencez par prendre un bloc d’exosome - un bloc de matrice solide contenant les exosomes intégrés. À l’aide d’un ultra-microtome, obtenir des coupes ultraminces du bloc d’exosomes.
Récupérez la section de l’exosome sur une grille appropriée et laissez-la adhérer à la surface. La grille fournit un support stable à l’échantillon d’exosome pour les étapes de coloration ultérieures.
Ensuite, placez la grille sur une goutte d’acétate d’uranyle - une coloration de métal lourd - et incubez pendant la durée souhaitée. Les ions uranyle interagissent avec les lipides, les protéines, les ADN et les ARN présents dans les exosomes.
Par la suite, colorez la section de l’exosome avec du citrate de plomb, qui se lie également aux biomolécules exosomales. Le citrate de plomb se lie faiblement aux ions uranyle pré-liés et améliore le contraste avec le bruit de fond pendant l’imagerie.
Observez les exosomes doublement colorés à l’aide de la TEM. La MET concentre le faisceau d’électrons sur l’échantillon d’exosome. Les régions colorées de l’exosome dispersent les électrons plus fortement que les régions non colorées.
L’ouverture de l’objectif filtre ces électrons fortement diffusés. Ainsi, les exosomes contenant des biomolécules colorées apparaissent plus foncés que l’arrière-plan.
À l’aide d’un ultra-microtome, préparez des sections d’une épaisseur de 60 nanomètres. Placez les sections sur une grille en nickel et colorez deux fois certaines d’entre elles avec de l’acétate d’uranyle à 2 % pendant 20 minutes, puis du citrate de plomb pendant 10 minutes. Ensuite, placez la section colorée dans un microscope électronique à transmission et visualisez l’échantillon à l’aide de 80 kV et suivez les réglages automatiques du temps d’exposition. Avec une image d’exosome en vue, acquérez et enregistrez l’image à l’aide du logiciel du microscope.
Aperçu
Cet article traite de la visualisation des exosomes par microscopie électronique en transmission (TEM). Il décrit les procédés de préparation et de coloration nécessaires pour améliorer le contraste des structures exosomales lors de l'imagerie.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Biophysique
Contexte
- Les exosomes sont des vésicules de taille nanométrique impliquées dans la communication intercellulaire.
- Ils contiennent diverses biomolécules, notamment de l'ADN, de l'ARN et des protéines.
- La microscopie électronique en transmission est un outil puissant pour visualiser les structures cellulaires.
- Les techniques de coloration sont essentielles pour améliorer le contraste des images en MET.
Objectif de l'étude
- Présenter un protocole détaillé pour la préparation des exosomes en vue de leur observation en microscopie électronique à transmission (MET).
- Montrer les effets de différentes méthodes de coloration sur la visualisation des exosomes.
- Mettre en évidence l'importance de la structure des exosomes dans la recherche biologique.
Méthodes utilisées
- Préparation de blocs d'exosomes à l'aide d'un ultramicrotome.
- Coloration à l'acétate d'uryle et au citrate de plomb.
- Observation au microscope électronique en transmission à 80 kV.
- Acquisition et sauvegarde des images à l'aide du logiciel du microscope.
Résultats principaux
- Les exosomes colorés apparaissent plus foncés par rapport au fond sur les images de microscopie électronique en transmission.
- Des sections ultraminces de 60 nanomètres sont optimales pour l'imagerie.
- L'acétate d'uranyle et le citrate de plomb améliorent efficacement le contraste.
- Le protocole permet une visualisation claire des structures des exosomes.
Conclusions
- Les méthodes décrites permettent une visualisation fiable des exosomes.
- Les techniques de coloration sont essentielles pour améliorer la qualité des images en microscopie électronique en transmission (TEM).
- Ce protocole peut aider les chercheurs à étudier la biologie des exosomes.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La visualisation à haute résolution des caractéristiques structurales des exosomes à l'aide de la microscopie électronique en transmission (MET) est essentielle pour la recherche précoce en biopharmaceutique, permettant une caractérisation précise des vésicules nanométriques impliquées dans la communication intercellulaire. Des protocoles d'imagerie fiables soutiennent la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques en confirmant l'intégrité des exosomes et leur contenu biomoléculaire. Cette capacité renforce la confiance prédictive aux points critiques de découverte et éclaire les décisions de tri du portefeuille.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet une visualisation directe de la morphologie des exosomes afin d'appuyer les efforts de validation ciblée.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en confirmant la présence et la structure des biomolécules exosomales.
- Renforce la confiance prédictive dans les hypothèses fondées sur les exosomes pour les modèles de maladies.
Développement de tests et criblage
- Fournit des sorties d'imagerie standardisées pour le développement de tests et la validation de systèmes.
- Garantit la reproductibilité et la comparabilité des préparations d'exosomes entre les expériences.
- Fournit des données structurales quantitatives permettant d'orienter les protocoles de criblage en aval.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne la caractérisation des exosomes avec les stratégies translationnelles de biomarqueurs lorsque les exosomes sont utilisés comme indicateurs pertinents pour la maladie.
- Assure la continuité du stade de découverte à la validation préclinique en confirmant l'intégrité des vésicules et de leur contenu.
- Réduit le risque de faire progresser des préparations d'exosomes mal caractérisées vers des études précliniques.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce protocole d'imagerie des exosomes basé sur la microscopie électronique en transmission s'inscrit dans le continuum entre la phase de découverte précoce et le stade préclinique, fournissant des données fondamentales pour la validation des cibles et la préparation des tests.
- Biologie de la découverte : Confirme la structure des exosomes et leur contenu biomoléculaire, soutenant les tests d'hypothèses et la clarification des voies biologiques.
- Criblage : Fournit des images reproductibles et quantitatives pour la standardisation des tests.
- Analytique : Permet la mesure de la taille, de la morphologie et de l'intensité de coloration des exosomes pour des analyses comparatives.
- Recherche translationnelle : Facilite l'alignement avec les stratégies de biomarqueurs lorsque les exosomes sont utilisés comme indicateurs translationnels.
- Réutilisation en entreprise : Établit un protocole d'imagerie standardisé applicable à plusieurs programmes de découverte.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la recherche sur les exosomes.
- Valeur opérationnelle : Fournit des images standardisées et reproductibles permettant des comparaisons entre équipes.
- Valeur stratégique : Permet de prendre des décisions éclairées d'aller/arrêt et de faire progresser de manière économiquement efficace les programmes basés sur les exosomes.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque en fournissant dès les premières étapes du processus des données structurales solides.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en ultramicrotomie, en coloration et en utilisation du MET.
- Exige un accès à des instruments de microscopie avancés et à une infrastructure analytique.
- Implique une standardisation interéquipes des protocoles de sectionnement et de coloration.
- Peut nécessiter des adaptations selon les sources d'exosomes ou les systèmes modèles.
- La durée de la préparation de l'échantillon et de la coloration doit être optimisée pour garantir une qualité d'imagerie constante.
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Dernière mise à jour : 22 août 2026