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0 vues • 2:32 min • April 30th, 2023
Les exosomes sont des vésicules sphériques de taille nanométrique entourées d’une bicouche lipidique contenant des molécules d’ADN, d’ARN et de protéines présentes à l’intérieur de la lumière.
Pour visualiser la structure de l’exosome à l’aide de la microscopie électronique à transmission, ou MET, commencez par prendre un bloc d’exosome - un bloc de matrice solide contenant les exosomes intégrés. À l’aide d’un ultra-microtome, obtenir des coupes ultraminces du bloc d’exosomes.
Récupérez la section de l’exosome sur une grille appropriée et laissez-la adhérer à la surface. La grille fournit un support stable à l’échantillon d’exosome pour les étapes de coloration ultérieures.
Ensuite, placez la grille sur une goutte d’acétate d’uranyle - une coloration de métal lourd - et incubez pendant la durée souhaitée. Les ions uranyle interagissent avec les lipides, les protéines, les ADN et les ARN présents dans les exosomes.
Par la suite, colorez la section de l’exosome avec du citrate de plomb, qui se lie également aux biomolécules exosomales. Le citrate de plomb se lie faiblement aux ions uranyle pré-liés et améliore le contraste avec le bruit de fond pendant l’imagerie.
Observez les exosomes doublement colorés à l’aide de la TEM. La MET concentre le faisceau d’électrons sur l’échantillon d’exosome. Les régions colorées de l’exosome dispersent les électrons plus fortement que les régions non colorées.
L’ouverture de l’objectif filtre ces électrons fortement diffusés. Ainsi, les exosomes contenant des biomolécules colorées apparaissent plus foncés que l’arrière-plan.
À l’aide d’un ultra-microtome, préparez des sections d’une épaisseur de 60 nanomètres. Placez les sections sur une grille en nickel et colorez deux fois certaines d’entre elles avec de l’acétate d’uranyle à 2 % pendant 20 minutes, puis du citrate de plomb pendant 10 minutes. Ensuite, placez la section colorée dans un microscope électronique à transmission et visualisez l’échantillon à l’aide de 80 kV et suivez les réglages automatiques du temps d’exposition. Avec une image d’exosome en vue, acquérez et enregistrez l’image à l’aide du logiciel du microscope.