Dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית Neuromuscular צומת

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע צביעה אימונו-פלואורסצנטית לחלבוני אזור פעיל בזחלי דרוזופילה שלישית וכוכב. זה מושג על ידי בחירה והצמדה של הזחלים כלפי מטה על צלחת הדיסקציה. השלב השני של ההליך הוא ניתוח הזחלים, הסרת רקמות עודפות כדי לחשוף את השרירים והצמתים העצביים-שריריים.

השלב השלישי של ההליך הוא צביעה חיסונית של פרוות הזחלים המנותחות ישירות בצלחת הדיסקציה. השלב האחרון של ההליך הוא הרכבת פרוות הזחלים על שקופית מיקרוסקופ. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות את מורפולוגיה האזור הפעיל של צומת עצב-שריר CHO באמצעות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירולוגיה, כגון ויסות חלבוני צומת עצביים-שריריים כמו שהיה מעורב בעבר במורפולוגיה של אזור פעיל כדי ליצור משטח חיתוך, שפכו סיגר, בסיס אלסטומר סיליקון 180 4 לתוך צלחת תרבית רקמה קטנה. הקפד לא למלא את הצלחת לחלוטין כך ששטח החיתוך יהיה נמוך מהשפה חתוך את פיני החיתוך לאורך של כשלושה עד חמישה מילימטרים להגברת קלות המניפולציה, והקפד שיהיו לפחות שישה סיכות לכל זחל מזנים פראיים ומוטנטיים. זהה ובחר זחלי כוכב שלישי נודדים שזוחלים באופן פעיל סביב דופן הבקבוקון וטרם החלו להתגלם.

הסר שני זחלים מכל גנוטיפ מהבקבוקונים והניח אותם בכלי כביסה מלא ב-PBS כדי להסיר פסולת תחת מיקרוסקופ סטריאו. הסר עודף לחות על משטח החיתוך בעזרת מגבון קים. סדרו את הזחלים כך שהצד הגבי פונה כלפי מעלה ושני קנה הנשימה הלבן נראים לאורך הצד הגבי של מרכז הזחלים.

קנה הנשימה באמצע הזחלים כשהם מסמנים את מקומו בקו האמצע הגבי שלו. סיכה מספר אחת ממש מעל ווי הפה, ולאחר מכן הנח את סיכה מספר שתיים במיקום הזנב ממש מעל הכדורים ובין קנה הנשימה. הוסף כמות קטנה של PBS לזחלים כדי למנוע ייבוש של הציפורן.

הקפד לשמור על גנוטיפים שונים מופרדים על ידי הצבת סיכה בין כל קבוצה. לאחר שהזחלים הוצמדו למטה, בצע חתך רוחבי על פני קנה הנשימה ממש מעל סיכה מספר שתיים. הכנס את המספריים שלך לחתך זה וחתוך לאורך קו האמצע הגבי בין קנה הנשימה עד למעלה מעבר לפין מספר אחת במידת הצורך.

בצעו ארבעה חתכים קטנים נוספים בחלק העליון והתחתון של כל צד של הציפורן כך שהצד השמאלי והצד הימני ייפתחו, מה שיאפשר לכם להצמיד אותם למטה מבלי למשוך את הציפורן. לאחר שכל פינה של הקוטיקולה מוצמדת שטוחה לכרית הניתוח, קבעו את זחלי הפילה עם פורמלדהיד 4%para למשך 20 עד 25 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר כ-25 דקות של זמן קיבוע, יש לשפוך את הפרפורם אלדהיד ולשטוף עם PB S3 פעמים בכל פעם עם הזחלים בטיפת PBS מתחת למיקרוסקופ הסטריאו, לתפוס את הקצה האחורי של אחד מקנה הנשימה בעזרת מלקחיים מנתחים ולשלוף אותו החוצה.

חזור על הפעולה עבור קנה הנשימה השני. תפוס חלק מגוף השומן האחורי או רקמת המעי ומשוך אותו החוצה מאזור הניתוח. לאחר הסרת רוב הרקמה האחורית, התמקדו בהסרת הרקמות הקטנות סביב המוח.

ברגע שפרוות הזחל נקייה מרקמה עודפת, ניתן לצבוע אותה ישירות על כרית החיתוך באמצעות נוגדן ראשוני לזיהוי האזור הפעיל, ואחריו נוגדן משני פלואורסצנטי לאחר צביעה אימונו-פלואורסצנטית של האזור הפעיל, השלב הבא הוא הרכבה של פרוות הזחלים של האימונו-סטיין. התחל בסילוק ונידוף השטיפה הסופית לאחר דגירה משנית של נוגדנים ופיפטה כמיליליטר אחד של 80% גליצרול. כדי לכסות את פרוות הזחלים של הסיכה, הסר את כל הסיכה מלבד אחת מכל זחל ולאחר מכן הנח שתי טיפות של אמצעי הרכבה על שקופית מיקרוסקופ.

הסר את הסיכה האחרונה ותפס את הזחלים בזנב בעזרת מלקחיים קהים. גרור את הזחלים בגליצרול ולאחר מכן הניח את הזחלים בטיפה הבינונית הראשונה ועשה את אותו הדבר עם הזחלים הנותרים מאותו גנוטיפ. לאחר שכל הזחלים נמצאים בטיפה הראשונה, תפסו את הזחלים בזה אחר זה וגררו אותם דרך הטיפה ולאחר מכן לאורך הקצוות היבשים של המגלשה כדי להסיר את רוב המדיום.

לאחר מכן הניחו את הזחלים בטיפה הבינונית ההרכבה השנייה. הכן את השקופית הסופית על ידי תיוג שלה והנחת צורת T קטנה של אמצעי הרכבה על השקופית. חזור על הליך הגרירה והייבוש עם הזחלים בטיפה השנייה, ולאחר מכן סדר את צד הציפורן של הזחלים כלפי מטה במדיום ההרכבה.

בשקופית האחרונה, הנח פתק כיסוי על השקופית כדי לכסות את הזחלים המנותחים בקצה ההתחלה בשורה העליונה של הטי הנח משקל קטן על החלקת הכיסוי למשך כחמש דקות כדי להבטיח שאמצעי ההרכבה יתפשט לחלוטין, ולאחר מכן הניח לו לשבת בחושך עד שאמצעי ההרכבה יתרפא. כדי להכין את השקופית למיקרוסקופיה, נגב את כל שאריות אמצעי ההרכבה ואטום את החלקת הכיסוי עם לק ציפורניים. הכיוון הנכון של פרוות זחלים רכובות מוצג כאן.

שימו לב שהפרוות שטוחות עם הציפורן כלפי מטה ושיש לפחות רוחב גוף זחל בין הפרוות. לאחר סיום חיתוכי הזחל, הצביעה וההרכבה. ניתן להשתמש במיקרוסקופיה כדי לזהות את שריר הזחלים המעניין הממוקם במקטעים שתיים עד שש.

באמצעות מטרה בעלת עוצמה גבוהה, ניתן להתמקד בסינפסה בודדת ולצלם תמונת מחסנית ZS עם מיקרוסקופ. מוצגת כאן תמונת הקרנה מקסימלית מייצגת של חלק מהסינפסה עם צביעת NC 82 בירוק וכתם פרה-סינפטי HRP באדום. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבצע צביעה חיסונית עבור חלבוני צומת עצב-שריר חשובים כמו אלה המעורבים במורפולוגיה של אזור פעיל.