ויזואליזציה של דפוס היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים ב
16 ביוני 2017
עבודה זו מפרטת שיטת אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית כדי לדמיין תחזיות נוירונים מוטוריים של שלב מאוחר 16 תסיסנית עוברי melanogaster . הכנת הפילה של עוברי קבוע מוכתמים נוגדן FasII מספק כלי רב עוצמה לאפיין את הגנים הנדרשים עבור pathoninding האקסון המנוע ואת ההכרה היעד במהלך התפתחות עצבית.
המטרה הכללית של ניסוי זה היא לנתח את דפוסי ההקרנה של נוירוני מוטוריקה בעוברים בשלב מאוחר של Drosophila melanogaster. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום ההתפתחות העצבית, כגון הדרכת אקסונים מוטוריים ויצירת תתי-גרעינים עצביים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת ויזואליזציה מדויקת של אקסונים מוטוריים בעוברים מתפתחים, מה שמאפשר ניתוח מהימן של סלילת נתיבי האקסונים ואיתור פגמים במצב היעד.
יום אחד לאחר הכנת פלטות איסוף הביצים, החליפו את הפלטות בפלטות חדשות המכילות נגיעה של משחת שמרים שהוכנה טריה. לאחר שלוש שעות על הפלטות הטריות, העבירו את הזבובים לבקבוקי מזון חדשים. דגרו את פלטות הביצים למשך לילה בטמפרטורה של 25 °C.
בבוקר, הוסיפו 1.8 milliliters של תמיסת PBT לצלחות. השתמשו במקלון צמר להוצאת העובריים. לאחר מכן, באמצעות פיפט של 1 milliliter, העבירו את העובריים והתמיסה למבחנה למיקרו-צנטריפוגה.
לאחר שהעוברים שוקעים לתחתית, שאבו כמה שיותר מהתמיסה. לאחר מכן, שטפו את העוברים פעמיים באמצעות מיליליטר אחד של PBT לכל שטיפה. כדי להסיר את המעטפת (decoreonate) מהעוברים, החליפו את השטיפה האחרונה במיליליטר אחד של 50% bleach ונערנו את המבחנה בתנועות נדנוד במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.
כדי להסיר את אבקת ההלבנה, שטפו את העוברים שלוש פעמים ב-PBT. לאחר מכן, החליפו את השטיפה האחרונה בחצי מיליליטר של 100% heptane ובחצי מיליליטר של 4% paraformaldehyde. כעת, דגרו את העוברים למשך 15 דקות תוך כדי נדנוד עדין.
בעקבות האינקובציה, הסר את שכבת התמיסה שמתחת והוסף שוב 500 µL של 100% methanol. כעת, נער את המבחנה בעוצמה במשך 30 שניות כדי לבצע דה-ויטליניזציה (devitellinization) לעוברים. לאחר מכן, הסר את התמיסה שמעלה, הוסף שוב 500 µL של 100% methanol ונער את המבחנה למשך 10 שניות נוספות.
לאחר ניעור המבחנה, הקש עליה כדי לסייע לעוברים לשקוע והסר כמה שיותר מהתמיסה. לאחר מכן, שטוף את העוברים קצרות ב-100% methanol. מיד לאחר מכן, שטוף את העוברים ב-PBT שלוש פעמים.
כעת, השביו את העוברים ב-1 mL של PBT טרי. דגרו את העוברים בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות כדי להכינם לצביעת LacZ. בזמן דגירת העוברים, הכינו אליקוט של 1 mL מתמיס צביעת X-gal.
חממו את המנה בבן-מריה בטמפרטורה של 65 °C עד להופעת עכירות. לאחר מכן, העבירו אותה לבלוק חימום בטמפרטורה של 37 °C. לאחר חימום העוברים במשך 15 דקות, הסירו את תמיסת ה-PBT והחליפו אותה במנה של 1 mL של תמיסת צביעה.
לאחר מכן, הוסיפו 20 µL של מצע X-gal. הדגרירו את המבחנה בטמפרטורה של 37 °C עם נעירה עדינה במשך כשעתיים עד ארבע שעות, עד להיווצרות משקא כחול. לאחר מכן, הסירו את תמיסת הצביעה ושטפו את העובריים שלוש פעמים עם PBT בטמפרטורת החדר.
לאחר השטיפות, השתמשו במחט בדיקה או בפינצטה כדי למיין ידנית את העוברים תחת מיקרוסקופ דיסקציה. אספו את העוברים הצבועים הרלוונטיים לתוך מבחנה של מיקרו-צנטריפוגה בנפח 0.5 mm באמצעות פיפט של 1 mL. לאחר מכן, שטפו את העוברים שנבחרו ב-0.4 mL של PBT.
לאחר מכן, החליפו את ה-PBT ב-0.3 milliliters של תמיסת חסימה והניחו לעובריים להדגיר עם ערבוב עדין למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, הוסיפו 75 microliters של הנוגדן הראשוני והמשיכו בהדגירה למשך הלילה. למחרת בבוקר, שטפו את העובריים ב-PBT למשך כשעתיים, תוך החלפת תמיסת השטיפה בערך כל 30 דקות.
לאחר השטיפה, יש להוסיף 0.3 milliliters של תמיסת חסימה המכילה את הנוגדן המשני ולהדגיר את המבחנה תוך כדי נדנוד עדין בטמפרטורת החדר למשך לילה. למחרת בבוקר, יש לשטוף את העובריים ב-PBT במשך כשלוש שעות. יש להחליף את ה-PBT לפחות חמש פעמים במהלך תקופת השטיפה.
לאחר השטיפה, השביו את העוברים ב-0.3 milliliters של תמיסת dab והוסיפו שני microliters של 3% hydrogen peroxide. לאחר מכן, דגרו אותם בחושך עם נדנוד עדין בטמפרטורת החדר עד להיווצרות כמות מספקת של משקע. תהליך זה אורך בדרך כלל 30 עד 60 דקות.
לאחר מכן, שטפו את העוברים ב-PBT ארבע פעמים והשביו אותם ב-0.2 milliliters של תמיסת קיבוע. כעת, הניחו לעוברים להגיע לשיווי משקל בחושך בטמפרטורה של 4 degrees Celsius. כדי לבצע פילטציה (filet) לעוברים, הניחו אותם על תגית זכוכית.
ראשית, העבירו אותם לטיפת גליצרול כאשר הצד הבטני פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ דיסקציה, חתכו את החלק הקדמי ואת רבע אורך הגוף, והסירו את האזור האחורי ביותר, שאינו מכיל אקסונים מוטוריים. כעת, באמצעות מחט בדיקה, העבירו את הדגימה אל מחוץ לגליצרול, כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה, ומקמו אותה בצורה אופקית בשדה הראייה.
השלב הבא דורש מחט טונגסטן דקה שהוכנסה לחלק החלול של גשש מחט, ולאחר מכן כופפה בקצה. באמצעות מחט הטונגסטן, בצעו חתך קטן בקצה האחורי של העובר והמשיכו לחתוך לאורך קו האמצע הגבי. ודאו שקצה מחט הטונגסטן אינו נוגע במשטח של למסבת הזכוכית במהלך הניתוח, כיוון שהמחט תתכופף בקלות כנגד הזכוכית.
לאחר מכן, החזירו את הדגימה בעזרת הפרובה אל טיפת הגליצרול ומקמו אותה כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה. שם, הפרדו את המעי מדופן הגוף על ידי פתיחה של כל דופן גוף לכיוון ונטרלי-לטרלי. שתי דפנות הגוף צריכות להיפרד זו מזו.
כעת, בעזרת הפרוב, העבירו בזהירות את מקלטי דופן הגוף אל על תבנית זכוכית. על התבנית, השתמשו במחט טונגסטן כדי להסיר את האיברים הפנימיים על ידי דחיפתם לצדדים. כדי לייצב את מחט הטונגסטן ולמנוע את פגיעתה, השאירו את המחט החלולה כפרוב והחזיקו את מחט הטונגסטן נשענת על פני השטח של תבנית הזכוכית בזמן התפעול שלה.
כעת, בצעו הרכבה של הדגימות בשמונה µL של תמיסת הרכבה על גשריות זכוכית חדשות. הצמידו כיסוי זכוכית ואטמו את הקצוות באמצעות לק ציפורניים רגיל. לאחר מכן, צלמו תמונות ברזולוציה גבוהה באמצעות אופטיקת DIC.
בשימוש בשיטה המתוארת, עוברים בשלב 16 נצבעו בנוגדן Fas2 והוכנו לצורך ויזואליזציה של הנוירונים המוטוריים והחצאי-סגמנטים הבטניים A3 ו-A4. בדרך כלל, לפחות שבעה נוירונים מוטוריים מאריכים ומקבצים (fasciculate) את האקסונים שלהם כדי ליצור ענף עצב מסוג ISNb. צרורים עצביים רבים סביבו היו ניתנים לזיהוי גם בהכנה זו. כאשר צרור העצבים הבין-סגמנטי מגיע לנקודת ההכרעה בשרירים 6 ו-7, שני אקסונים נפרדים באופן סלקטיבי מהצמיגה (de-fasciculate) ומעצבבים את שרירים 6 ו-7.
דבר דומה קורה בנקודות בחירה אחרות ככל שהצרור מתפשט גבייה (דורסלית). לאחר מכן, בנקודת הבחירה האחרונה, שני אקסונים מעצבבים את שריר 12. לעומת זאת, בעוברים עם מוטציה ב-Sema-1a, אותם אקסונים אינם מצליחים להיפרד (defasciculate) בנקודות הבחירה שלהם.
תוצאה זו אינה מפתיעה, שכן ידוע כי חלבון ה-Sema-1 aegean מסייע ביצירת קשרים בין אקסונים מוטוריים לשרירי המטרה במהלך ההתפתחות העצבית. לפיכך, ניתן להשתמש בשיטה המתוארת כדי לנתח פנוטיפים של מוטנטים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן המיון של עוברים מוטנטיים רצויים, כיצד לבצע צביעה אימונוהיסטוכימית של תבניות ההקרנה האקסונית של נוירונים מוטוריים, וכיצד להבצע דיסקציה של עוברים מקובעים לצורך הכנת דגימה שטוחה (flat preparation).
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
עבודה זו מפרטת שיטה סטנדרטית של אימונוהיסטוכימיה להדמיה של השליחות של נוירונים מוטוריים בעוברי *Drosophila melanogaster* בשלב מאוחר של stage-16. השיטה מספקת הדמיה מדויקת של סלילת נתיבי האקסונים המוטוריים וזיהוי המטרות במהלך ההתפתחות העצבית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי העצבים
- ביולוגיה התפתחותית
- אימונוהיסטוכימיה
רקע
- דפוסי ההקרנה של נוירונים מוטוריים הם חיוניים להבנת ההתפתחות העצבית.
- *Drosophila melanogaster* משמש כאורגניזם מודל לחקר תהליכים אלו.
- אימונוהיסטוכימיה מאפשרת ויזואליזציה מפורטת של מבנים נוירונליים.
- הבנת התניחות של אקסונים יכולה לספק תובנות לגבי היווצרות מעגלים עצביים.
מטרת המחקר
- לניתוח דפוסי ההקרנה של נוירונים מוטוריים בעוברים בשלב מאוחר.
- לחקירת הגנים המעורבים בהנחיית אקסונים מוטוריים.
- לשיפור ההבנה של מנגנוני ההתפתחות העצבית.
שיטות שהשתמשו בהן
- הכנת פילטים של עוברי Drosophila מקובעים.
- צביעה באמצעות נוגדן FasII לצורך ויזואליזציה.
- ניתוח של סלילת נתיבי אקסונים מוטוריים וזיהוי מטרות.
- פרוטוקולים של דגירה והכנה של עוברי עוברים.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של השלוחות של נוירונים מוטוריים.
- זיהוי גנים מרכזיים המעורבים בהנחיית אקסונים.
- תובנות לגבי מנגנוני ההתפתחות העצבית.
- ביסוס שיטה אמינה למחקרים עתידיים.
מסקנות
- שיטת האימונוהיסטוכימיה יעילה לחקר השליחות של נוירונים מוטוריים.
- גישה זו יכולה לסייע בביאור הבסיס הגנטי של ההתפתחות העצבית.
- הממצאים תורמים להבנה רחבה יותר של סלילת נתיבי האקסונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ויזואליזציה מדויקת של תבניות ההקרנה האקסונית בנוירונים מוטוריים של עוברים של Drosophila מאפשרת בחינה מעמיקה של היווצרות מעגלים עצביים ומנגנוני הנחיית אקסונים. יכולת זו היא קריטית להפחתת סיכונים בשלבי תיקוף המטרה המוקדמים במחקר נוירו-התפתחותי, ותומכת באמון חיזוי בצינורות של סריקה גנטית. השחזוריות של השיטה והתוצרים הכמותיים שלה מקלים על אינטגרציה של מו"פ רב-תחומי ותעדוף תיקי פרויקטים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הערכה ישירה של תפקוד גנים בניתוב אקסונים מוטוריים ובזיהוי מטרות.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטיים באמצעות ויזואליזציה של השלכות פנוטיפיות של שיבושים גנטיים.
- מקל על תיקוף תפקודי של מטרות באמצעות סריקות גנטיות של אובדן תפקוד (loss-of-function) והגברת תפקוד (gain-of-function).
- מספק פלטפורמה לחקירה מונחית-השערה של מסלולי התפתחות עצבית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק פרוטוקולים סטנדרטיים של אימונוהיסטוכימיה וניתוח (dissection) להכנת דגימות ניתנת לשחזור.
- מייצר תוצאות כמותיות ואיכותיות של דפוסי היטל אקסוניים עבור יישומי סריקה.
- מאפשר הערכה ניתנת להרחבה (scalable) של וריאנטים גנטיים המשפיעים על קישוריות נוירו-שרירית.
- מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור תהליכי עבודה של סריקה פנוטיפית בהמשך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלה לצורך חקר היווצרות ותפקוד לקוי של מעגלים נוירו-שריריים.
- תומך בזיהוי סמנים ביולוגיים תרגומיים על ידי קישור הפרעות גנטיות לפנוטיפים ניתנים לצפייה.
- מספק רציפות משלב הסריקות הגנטיות של תגליות ועד לתיקוף של מודלים פרה-קליניים.
- מפחית סיכונים בקבלת החלטות על קידום המחקר על ידי הבהרת הבסיס המכניסטי של ההתפתחות העצבית.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow Integration)
פרוטוקול הוויזואליזציה זה משתלב ברצף הגילוי, החל מזיהוי מטרות גנטיות דרך סריקה פנוטיפית ועד לתיקוף של מודלים פרה-קליניים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים בהכוונת אקסונים ובהרכבת מעגלים עצביים.
- סריקה: מספק פלט כמותי הניתן לשחזור לצורך השוואת מצבים גנטיים וסריקת גנים מועמדים.
- אנליטיקה: מאפשר ניתוח סטטיסטי של דפוסי היטלי אקסונים להבחנה בין מחלקות פנוטיפיות.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאי גילוי מוקדמים למודלים פרה-קליניים רלוונטיים למחלות של הפרעות נוירו-שריריות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר עבור יוזמות מתמשכות של סריקה גנטית ופנוטיפית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי התפתחות עצבית.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה להכנת דגימות ולדימות לצורך הדירות ויכולת הרחבה בין צוותי מו"פ.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מוקדמת של מטרות גנטיות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של תוכניות מחקר נוירו-שריריות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגנטיקה של Drosophila, אימונוהיסטוכימיה ודיסקציה של עוברי דרוזופילה.
- דורש גישה לפלטפורמות דימוי ברזולוציה גבוהה ולריאגנטים של נוגדנים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של טיפול בדגימות ופרוטוקולי צביעה.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמה לרקעים גנטיים שונים או לשלבי התפתחות שונים.
- התפוקה עשויה להיות מוגבלת בשל שלבי הדיסקציה והדימוי הידניים.
שאלות נפוצות בנושאי ביו-פרמה
Chapters in this video
0:05
Title
11:21
Conclusion
10:03
Results: Intersegmental Nerve Bundle (ISNb) Innervation at A3 and A4
0:48
Preparation of Late-stage Embryos for Immunostaining
4:19
LacZ Staining and Immunostaining
7:20
Preparing Embryos to Image the ISN Nerves in Abdominal Segments 7 to A9
