ויזואליזציה של דפוס היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים ב תסיסנית
June 16th, 2017
עבודה זו מפרטת שיטת אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית כדי לדמיין תחזיות נוירונים מוטוריים של שלב מאוחר 16 תסיסנית עוברי melanogaster . הכנת הפילה של עוברי קבוע מוכתמים נוגדן FasII מספק כלי רב עוצמה לאפיין את הגנים הנדרשים עבור pathoninding האקסון המנוע ואת ההכרה היעד במהלך התפתחות עצבית.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לנתח את דפוסי הקרנת הנוירונים המוטוריים בעוברים בשלב מאוחר של Drosophila melanogaster. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההתפתחות העצבית, כגון הנחיית אקסון מוטורי והיווצרות תת-עצבי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת הדמיה מדויקת של האקסון המוטורי בעוברים מתפתחים, המאפשרת ניתוח אמין של מציאת נתיב אקסונלי ומיקוד הפגם במצב.
יום לאחר הקמת צלחות איסוף הביצים, החליפו את הצלחות בחדשות המכילות מעט רסק שמרים טרי. לאחר שלוש שעות על הצלחות הטריות, העבירו את הזבובים לבקבוקי מזון חדשים. ודוגרים את צלחות הביצים למשך הלילה בחום של 25 מעלות צלזיוס.
בבוקר מוסיפים 1.8 מיליליטר תמיסת PBT לצלחות. והשתמש בצמר גפן כדי לעקור את העוברים. לאחר מכן, בעזרת פיפטה של 1 מיליליטר, העבירו את העוברים והתמיסה לצינור מיקרו צנטריפוגה.
לאחר שהעוברים מתיישבים לתחתית, שאפו כמה שיותר תמיסה. לאחר מכן שטפו את העוברים פעמיים באמצעות מיליליטר PBT אחד לכל שטיפה. כדי לפרק את העוברים, החליפו את השטיפה האחרונה במיליליטר אחד של 50% אקונומיקה ונדנדו את הצינור למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.
כדי להסיר את האקונומיקה, שטפו את העוברים שלוש פעמים עם PBT. לאחר מכן, החלף את השטיפה האחרונה בחצי מיליליטר של 100% הפטן וחצי מיליליטר של 4% פרפורמלדהיד. כעת, דגרו על העוברים למשך 15 דקות עם נדנוד עדין.
לאחר הדגירה, הסר את שכבת התמיסה הבסיסית והוסף בחזרה 500 מיקרוליטר של 100% מתנול. כעת, למשך 30 שניות, נער את הצינור במרץ כדי להוציא את העוברים. לאחר מכן, הסר את התמיסה שמעליו, הוסף בחזרה 500 מיקרוליטר של 100% מתנול ונער את הצינור למשך 10 שניות נוספות.
לאחר ניעור הצינור, הקש עליו כדי לעזור לעוברים להתיישב ולהסיר כמה שיותר תמיסה. לאחר מכן, שטפו בקצרה את העוברים עם 100% מתנול. לאחר מכן, שטפו מיד את העוברים עם PBT שלוש פעמים.
כעת, השעו את העוברים במיליליטר אחד של PBT טרי. ודגרו על העוברים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי להכין אותם לצביעה של LacZ. בזמן שהעוברים דוגרים, הכינו מינון של מיליליטר אחד של תמיסת צביעה X-gal.
מחממים את האליקוט באמבט מים של 65 מעלות צלזיוס עד שהוא מתענן. לאחר מכן העבירו אותו לגוש חום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר חימום העוברים במשך 15 דקות, הסר את תמיסת ה-PBT, והחלף אותה במיליליטר אחד של תמיסת צביעה.
לאחר מכן הוסף 20 מיקרוליטר של מצע X-gal. במשך כשעתיים עד ארבע שעות, דגרו את הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם נדנוד עדין עד שנוצר משקע כחול. לאחר מכן, הסר את תמיסת הצביעה ושטוף את העוברים שלוש פעמים עם PBT בטמפרטורת החדר.
לאחר השטיפה, השתמש בבדיקת מחט או במלקחיים כדי למיין את העוברים ביד תחת מיקרוסקופ דיסקציה. אוספים את העוברים המוכתמים המעניינים לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה של חצי מילימטר באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד. לאחר מכן, שטפו את העוברים שנבחרו עם 0.4 מיליליטר PBT.
לאחר מכן, החלף את ה-PBT ב-0.3 מיליליטר של תמיסת חסימה ואפשר לעוברים לדגור בתסיסה עדינה למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות מוסיפים 75 מיקרוליטר מהנוגדן הראשוני וממשיכים את הדגירה למשך הלילה. למחרת בבוקר יש לשטוף את העוברים ב- PBT למשך כשעתיים, ולהחליף את תמיסת הכביסה כל 30 דקות בערך.
לאחר הכביסה יש להוסיף 0.3 מיליליטר של תמיסת חסימה המכילה את הנוגדן המשני ולדגור את הצינור עם נדנוד עדין בטמפרטורת החדר למשך הלילה. למחרת בבוקר יש לשטוף את העוברים ב-PBT למשך כשלוש שעות. החלף את ה-PBT לפחות חמש פעמים במהלך תקופת הכביסה.
לאחר הכביסה יש להשעות את העוברים ב 0.3 מיליליטר תמיסת טפיחה ולהוסיף שני מיקרוליטר של מי חמצן 3%. לאחר מכן, דגרו אותם בחושך עם נדנוד עדין בטמפרטורת החדר עד להפקת מספיק משקעים. זה בדרך כלל לוקח 30 עד 60 דקות.
לאחר מכן, שטפו את העוברים עם PBT ארבע פעמים והשעו אותם מחדש ב-0.2 מיליליטר של תמיסת הרכבה. כעת, אפשרו לעוברים להתייצב בחושך ב-4 מעלות צלזיוס. כדי להגיש את העוברים, ביימו אותם על מגלשת זכוכית.
ראשית העבירו אותם לטיפה של גליצרול בצד הגחון כלפי מעלה. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ דיסקציה, חתכו את החלק הקדמי ו -1/4 מאורך הגוף והסירו את האזור האחורי ביותר, הנקי מאקסונים מוטוריים. כעת, בעזרת בדיקת מחט, הזיזו את התכשיר מהגליצרול, כשהצד הגבי מכוון כלפי מעלה ומקמו אותו אופקית בשדה הראייה.
השלב הבא דורש מחט טונגסטן עדינה שהוחדרה לאזור החלול של בדיקת מחט, ולאחר מכן כפופה בקצה. בעזרת מחט הטונגסטן מבצעים חתך קטן בקצה האחורי של העובר וממשיכים לחתוך את קו האמצע הגבי. ודא שקצה מחט הטונגסטן אינו נוגע במשטח מגלשת הזכוכית במהלך הדיסקציה, מכיוון שהמחט תתכופף בקלות כנגד הזכוכית.
לאחר מכן, עם הגשושית החזירו את ההכנה לטיפת הגליצרול ומקמו אותה בצד הגב כלפי מעלה. שם, נתק את המעי מדופן הגוף על ידי פתיחת כל דופן גוף בכיוון הגחון-לרוחב. שני קירות הגוף צריכים להתפרק.
כעת, בעזרת הגשושית, הזיזו בזהירות את דשי קיר הגוף על מגלשת זכוכית. בשקופית, השתמש במחט טונגסטן כדי להסיר את האיברים הפנימיים על ידי דחיפתם לרוחב. כדי לייצב את מחט הטונגסטן ולמנוע ממנה להינזק, שמור על המחט החלולה נבדק והחזק את מחט הטונגסטן צמודה אל פני מגלשת הזכוכית תוך מניפולציה של מחט הטונגסטן.
כעת, הרכיבו את התכשירים בשמונה מיקרוליטר של תמיסת הרכבה על מגלשת זכוכית חדשה. צרף תלוש כיסוי ואטום את הקצוות כלפי מטה עם לק רגיל. לאחר מכן, צלם תמונות ברזולוציה גבוהה באמצעות אופטיקה של DIC.
באמצעות השיטה המתוארת, עוברי שלב 16 נצבעו בנוגדני Fas2 והוכנו להדמיה של הנוירונים המוטוריים ומקטעי חצי הבטן A3 ו-A4. בדרך כלל, לפחות שבעה נוירונים מוטוריים מתרחבים ומרתקים את האקסונים שלהם ליצירת ענף עצב ISNb. צרורות עצבים רבים מסביב היו ניתנים לזיהוי גם בתכשיר זה. כאשר צרור העצבים הבין-סגמנטלי מגיע לנקודת הבחירה בשריר 6 ו-7, שני אקסונים מבטלים באופן סלקטיבי את שרירי 6 ו-7.
אותו הדבר קורה בנקודות בחירה אחרות כאשר החבילה נמשכת בגב. ואז, בנקודת הבחירה האחרונה, שני אקסונים מעכבים את שריר 12. לעומת זאת, בעוברים מוטנטיים של Sema-1a אותם אקסונים לא מצליחים להתפרק בנקודות הבחירה שלהם.
זה לא בלתי צפוי מכיוון שהתוצר האגאי Sema-1 ידוע כמסייע ביצירת קשרים בין אקסונים מוטוריים לשרירי מטרה במהלך ההתפתחות העצבית. לפיכך, ניתן להשתמש בשיטה המתוארת לניתוח פנוטיפים מוטנטיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למיין את העוברים המוטנטיים הרצויים, כיצד לצבוע את דפוסי ההקרנה האקסונלית של נוירונים מוטוריים, וכיצד לנתח עוברים קבועים להכנה שטוחה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
עבודה זו מפרטת שיטת אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית לדמיית קרינה של נוירונים מוטוריים של עוברים של דרוזופילה מלונוגסטר בשלב מאוחר שלב-16. השיטה מספקת דמייה מדויקת של מציאת נתיב של אקסונים מוטוריים וזיהוי יעדים במהלך התפתחות עצבית.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירו-מדע
- ביולוגיה התפתחותית
- אימונוהיסטוכימיה
רקע
- דפוסי קרינה של נוירונים מוטוריים חיוניים להבנת ההתפתחות העצבית.
- דרוזופילה מלונוגסטר משמשת כאורגניזם מודלי לחקר תהליכים אלו.
- אימונוהיסטוכימיה מאפשרת דמייה מפורטת של מבנים עצביים.
- הבנת הנחיית האקסונים יכולה לספק תובנות לגבי היווצרות מעגלים עצביים.
מטרת המחקר
- לנתח דפוסי קרינה של נוירונים מוטוריים בעוברים בשלב מאוחר.
- לחקור את הגנים המעורבים בהנחיית אקסונים מוטוריים.
- להעמיק את ההבנה של מנגנוני ההתפתחות העצבית.
שיטות ששימשו
- הכנת עוברים קבועים של דרוזופילה ללא קרביים.
- צביעה עם נוגדן FasII לצורך הדמייה.
- ניתוח מציאת נתיב של אקסונים מוטוריים וזיהוי יעדים.
- פרוטוקולי דגירה והכנה של עוברים.
תוצאות עיקריות
- הדמייה מוצלחת של קרינה של נוירונים מוטוריים.
- זיהוי גנים מרכזיים המעורבים בהנחיית אקסונים.
- תובנות לגבי מנגנוני ההתפתחות העצבית.
- ביסוס שיטה אמינה למחקרים עתידיים.
מסקנות
- שיטת האימונוהיסטוכימיה יעילה לחקר קרינה של נוירונים מוטוריים.
- גישה זו יכולה לסייע בבירור הבסיס הגנטי של ההתפתחות העצבית.
- הממצאים תורמים להבנה הרחבה יותר של מציאת נתיב האקסונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Precise visualization of axonal projection patterns in embryonic Drosophila motor neurons enables robust interrogation of neural circuit formation and axon guidance mechanisms. This capability is critical for de-risking early-stage target validation in neurodevelopmental research and supports predictive confidence in genetic screening pipelines. The method's reproducibility and quantitative outputs facilitate cross-functional R&D integration and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct assessment of gene function in motor axon pathfinding and target recognition.
- Supports mechanistic de-risking by visualizing phenotypic consequences of genetic perturbations.
- Facilitates functional target validation through loss-of-function and gain-of-function genetic screens.
- Provides a platform for hypothesis-driven interrogation of neural development pathways.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized immunohistochemistry and dissection protocols for reproducible sample preparation.
- Generates quantitative and qualitative readouts of axonal projection patterns for screening applications.
- Enables scalable evaluation of genetic variants affecting neuromuscular connectivity.
- Prepares validated biological systems for downstream phenotypic screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for studying neuromuscular circuit formation and dysfunction.
- Supports translational biomarker identification by linking genetic perturbations to observable phenotypes.
- Provides continuity from discovery-stage genetic screens to preclinical model validation.
- De-risks advancement decisions by clarifying mechanistic underpinnings of neural development.
Pipeline & Workflow Integration
This visualization protocol integrates into the discovery continuum from genetic target identification through phenotypic screening and preclinical model validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in axon guidance and neural circuit assembly.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for comparing genetic conditions and screening candidate genes.
- Analytics: Enables statistical analysis of axonal projection patterns to distinguish phenotypic classes.
- Translational Research: Bridges early discovery findings to disease-relevant preclinical models of neuromuscular disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for ongoing genetic and phenotypic screening initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in neural development studies.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and imaging for reproducibility and scalability across R&D teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling early de-risking of genetic targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neuromuscular research programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, immunohistochemistry, and embryonic dissection.
- Demands access to high-resolution imaging platforms and antibody reagents.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling and staining protocols.
- Adaptation may be needed for different genetic backgrounds or developmental stages.
- Throughput may be limited by manual dissection and imaging steps.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
11:21
Conclusion
10:03
Results: Intersegmental Nerve Bundle (ISNb) Innervation at A3 and A4
0:48
Preparation of Late-stage Embryos for Immunostaining
4:19
LacZ Staining and Immunostaining
7:20
Preparing Embryos to Image the ISN Nerves in Abdominal Segments 7 to A9
