Une méthode simple et efficace pour isoler les macrophages de mixte cultures primaires de cellules hépatiques adultes

L'objectif général de l'expérience suivante est d'obtenir plusieurs cultures de macrophages à partir de cultures primaires mixtes de cellules hépatiques de rat, sans nécessiter d'équipement complexe ni de compétences particulières. Cette procédure commence par la dissociation des cellules hépatiques de rat adulte par perfusion au collagénase, suivie de l'isolement de la fraction cellulaire parenchymateuse d'hépatocytes. Ensuite, les cellules sont incubées dans des flacons de culture tissulaire de type T 75 contenant un milieu de croissance, afin d'établir des cultures primaires mixtes de cellules hépatiques.

Ensuite, après 10 à 12 jours de culture, les flacons de culture sont agités afin de faciliter le transfert des macrophages vers des boîtes en plastique, à partir desquelles ils sont ensuite récoltés par adhésion sélective après une courte période d'incubation. Enfin, plus de 10 fois, six cellules peuvent être récoltées de manière répétée à partir des mêmes flacons de culture tissulaire T 75, tous les deux à trois jours, pendant plus de deux semaines. Les méthodes d'isolement des macrophages hépatiques ont été bien décrites.

Cependant, la plupart des méthodes précédentes nécessitent un équipement sophistiqué, tel qu'un illustrateur centrifuge, ainsi que des compétences techniques pointues. Nous présentons ici une méthode simple et nouvelle permettant d'obtenir des macrophages hépatiques en nombre et en pureté suffisants à partir de cultures primaires mixtes de cellules hépatiques adultes enroulées, méthode qui ne requiert aucun équipement particulier ni compétences de laboratoire avancées. La dissection animale, la perfusion du foie et la préparation des cytes seront démontrées par les docteurs Norco, Yamanaka et Miko Yoshioka à l'Institut national de santé animale.

Ensuite, l'isolement et la purification des macrophages hépatiques à partir des risques culturels seront présentés par le Dr. Taketo Takeno à l'Institut National des Sciences Agrobiologiques. Commençons donc. Pour préparer la perfusion du foie de rat, commencez par préchauffer une bouteille de solution de lavage et une bouteille de solution de collagénase.

Ensuite, après avoir confirmé la sédation par une pincée de la peau, placer un rat mâle adulte anesthésié dans un bac en acier inoxydable et vaporiser de l'éthanol à 70 % sur son abdomen et son thorax. Puis, pratiquer une petite incision au milieu de l'abdomen à l'aide de ciseaux de dissection et rabattre la peau. Ensuite, ouvrir l'abdomen avec les ciseaux et confirmer l'emplacement de la veine porte.

Ensuite, passez le fil chirurgical sous la veine porte et serrez légèrement le fil. Puis, clampsez la partie distale de la veine cave inférieure et de la veine mésentérique à l’aide d’un clamp de type moustique afin d’empêcher le reflux sanguin vers le foie. Ouvrez la cavité thoracique en coupant le diaphragme avec des ciseaux et exposez le cœur ; après avoir pratiqué une petite incision dans la veine porte à l’aide de ciseaux ophtalmiques, insérez un cathéter plastique de deux millimètres dans la veine et serrez fermement le fil autour du cathéter.

Chargez un système de perfusion avec la solution de lavage préchauffée, puis connectez-le au cathéter. Commencez la perfusion dans C deux à un débit de 10 millilitres par minute. En même temps, effectuez une incision dans la paroi de l'oreillette droite à l’aide de ciseaux de dissection.

Poursuivez la perfusion pendant 10 minutes, puis remplacez la solution de perfusion par la solution de collagénase et perfusez de 10 à 20 minutes. À un débit de 10 millilitres par minute, remplissez un bécher stérile avec 25 millilitres de solution de collagénase. Ensuite, retirez le foie perfusé et placez-le soigneusement dans le bécher.

Hacher le foie en petits morceaux à l’aide de ciseaux. Ajouter 75 millilitres de MEM froid à la suspension cellulaire obtenue. Après un pipetage doux, filtrer la suspension à travers un tamis cellulaire de 100 micromètres.

Pour éliminer le tissu conjonctif présent dans les fragments de tissu non digérés, recueillir le filtrat dans des tubes coniques de 50 millilitres. Transférer le filtrat dans des tubes coniques de 50 millilitres et laver les cellules quatre fois en centrifugeant d'abord les cellules à 50 G pendant une minute à quatre degrés Celsius. Avec le frein désactivé, éliminer soigneusement le surnageant, puis resuspendre le culot dans du MEM froid et centrifuger à nouveau les cellules après le dernier lavage.

Ressuspendez les cellules hépatiques dans le milieu de croissance. Ensuite, semez les cellules dans cinq à dix flacons de culture tissulaire T 75 à une densité de 6,7 × 10⁴ cellules par centimètre carré. Placez les flacons de culture dans un incubateur et remplacez le milieu de croissance tous les deux à trois jours.

Après un jour de culture, les hépatocytes parenchymateux s'étalent à la surface du flacon et présentent une morphologie typique, polygonale et semblable à des pavés, avec un ou deux noyaux ronds. En quelques jours de culture, les hépatocytes parenchymateux perdent leur morphologie de cellules épithéliales et se transforment en cellules fibroblastiques plus aplaties. Vers le sixième jour, des cellules rondes brillantes, semblables à des macrophages, commencent à proliférer sur la couche de cellules fibroblastiques observée en contraste de phase. La croissance des cellules de type macrophage atteint un maximum vers le jour 12.

Le nombre de cellules de type macrophage diminue vers le 19e jour, lorsque la feuille de cellules fibroblastiques commence à se dégrader. Ainsi, entre sept et dix jours de culture, nous mettons en suspension dans le milieu de culture les macrophages qui se sont multipliés sur la feuille de cellules, en agitant doucement les flacons de culture de manière réciproque pendant 30 minutes après avoir remis en suspension les macrophages. Répartir le milieu provenant de deux flacons T75 dans chacune des boîtes plastiques non adaptées à la culture tissulaire de 100 millimètres.

Remplissez à nouveau les flacons de culture avec le milieu de croissance et replacez-les dans l’incubateur. Incubez les boîtes en plastique pendant 30 minutes après la période d’incubation, puis lavez les boîtes trois fois en aspirant le milieu et en rinçant doucement la boîte plastique avec du PBS, comme indiqué ici, dès 10 minutes après la mise en culture, lorsque les cellules de type macrophage se sont attachées à la surface de la boîte tandis que les autres cellules fibroblastiques contaminantes restent en suspension. Après le rinçage au PBS, on obtient une population de macrophages hautement purifiée.

Comme on le voit sur cette figure, les cellules acquièrent une morphologie typique de macrophages après 40 minutes de culture, et des cellules en mitose sont fréquemment observées, comme indiqué par les flèches. Pour recueillir cette nouvelle population de macrophages hautement purifiée, ajoutez un millilitre de solution trip LE Express aux cellules lavées et replacez les boîtes dans l'incubateur pendant 10 minutes supplémentaires. Après cette période d'incubation, ajoutez neuf millilitres de milieu de croissance, puis détachez délicatement les macrophages adhérents à l’aide du grattoir à cellules et transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez et jetez le surnageant.

Ajoutez un millilitre de milieu de croissance, dissociez les agrégats cellulaires resuspendus en cellules individuelles par pipetage vigoureux, déterminez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre comme indiqué sur ce graphique ; plus de 10 des six cellules peuvent être récoltées à partir d’un flacon de culture T 75 de manière répétée tous les deux à trois jours pendant plus de deux semaines, permettant un rendement cellulaire total de 10 à la puissance sept par flacon de culture T 75. Comme le montrent ces images, les cellules isolées sont immunomarquées avec des anticorps monoclonaux dirigés contre des antigènes de macrophages de rat tels que CD 68 ou ED un et CD 1 72 A ou OX 41. Ces cellules possèdent des propriétés fonctionnelles de macrophages, telles qu’une phagocytose active de microbilles marquées avec la FITC.

Dans cette vidéo, nous avons présenté une méthode simple et efficace pour obtenir des macrophages à partir de cultures primaires mixtes de cellules hépatiques rouges adultes. Notre protocole ne nécessite ni équipement complexe ni compétences particulières, mais permet d'obtenir un nombre suffisant de macrophages purs, pouvant être récoltés à plusieurs reprises à partir de la même culture de foie. Cette méthode peut être appliquée à d'autres espèces de mammifères.

Merci d'avoir regardé la vidéo et bonne chance dans vos futures expériences. Santé.