Une méthode simple et efficace pour isoler les macrophages de mixte cultures primaires de cellules hépatiques adultes

L’objectif global de l’expérience suivante est d’obtenir plusieurs cultures de macrophages à partir de cultures primaires mixtes de cellules hépatiques de rat sans avoir besoin d’équipement ou de compétences complexes. Ceci est réalisé d’abord par dissociation des cellules hépatiques de rat adulte par perfusion de collagénase, suivie de l’isolement de la fraction de cellules hépatocytaires parenchymateuses. Ensuite, les cellules sont incubées dans des flacons de culture tissulaire T 75 avec un milieu de croissance pour établir des cultures primaires mixtes de cellules hépatiques.

Ensuite, après 10 à 12 jours de culture, les flacons de culture sont secoués pour faciliter le transfert des macrophages dans des boîtes en plastique à partir desquelles ils sont ensuite récoltés par adhésion sélective après une courte période d’incubation. Enfin, plus de 10 des six cellules peuvent être récoltées à plusieurs reprises dans les mêmes flacons de culture tissulaire T 75 à deux à trois jours d’intervalle pendant plus de deux semaines. Les méthodes d’isolement des macrophages hépatiques ont été bien décrites.

Cependant, la plupart des méthodes précédentes nécessitent un équipement sophistiqué tel qu’un illustrateur centrifuge et des compétences techniques raffinées. Nous présentons ici une méthode simple et nouvelle pour obtenir des macrophages hépatiques en nombre et en pureté suffisants à partir de cultures primaires mixtes de cellules hépatiques adultes enveloppées qui ne nécessitent aucun équipement spécial ou compétences de laboratoire avancées. La dissection animale, la perfusion du foie et la préparation des cytes seront démontrées par les docteurs Norco, Yamanaka et Miko Yoshioka de l’Institut national de la santé animale.

Ensuite, l’isolement et la purification des macrophages hépatiques contre les risques culturels seront démontrés par le Dr Taketo Takeno de l’Institut national des sciences agrobiologiques. Alors commençons. Pour vous préparer à la profusion du foie de rat, commencez par préchauffer une bouteille de solution de lavage et une bouteille de solution de collagénase.

Ensuite, après avoir confirmé la sédation par pincement cutané, placez un rat mâle adulte anesthésié dans une casserole en acier inoxydable et vaporisez de l’éthanol à 70 % sur son abdomen et son thorax. Ensuite, faites une petite incision au milieu de l’abdomen avec des ciseaux à dissection et retirez la peau. Ouvrez ensuite l’abdomen avec les ciseaux et confirmez l’emplacement de la veine porte.

Ensuite, passez le fil chirurgical sous la veine porte et serrez légèrement le fil. Ensuite, clampez la partie distale du vanoc cave inférieur et de la veine mésentérique avec une pince anti-moustiques pour éviter le reflux sanguin dans le foie. Ouvrez la cavité thoracique en coupant le diaphragme avec des ciseaux et exposez le cœur après avoir fait une petite incision dans la veine porte avec des ciseaux ophtalmiques, insérez un cathéter en plastique de deux millimètres dans la veine et serrez fermement le fil autour du cathéter.

Chargez un système de perfusion avec la solution de lavage préchaude, puis connectez-le au cathéter. Commencer la perfusion en C deux à un rythme de 10 millilitres par minute. Dans le même temps, faites une incision dans la paroi de l’oreillette droite avec des ciseaux de dissection.

Continuez la profusion pendant 10 minutes, puis passez la solution de profusion à la solution de collagénase et perfuser pendant 10 à 20 minutes. À raison de 10 millilitres par minute, remplissez un bécher stérile avec 25 millilitres de solution de collagénase. Retirez ensuite et placez délicatement le foie perfusé dans le bécher.

Coupez le foie en petits morceaux avec des ciseaux. Ajoutez 75 millilitres de MEM froid dans la suspension cellulaire résultante. Après un pipetage doux, filtrez la suspension à travers une crépine à cellules de 100 micromètres.

Pour éliminer le tissu conjonctif dans les fragments de tissu non digérés, collectez le filtrat dans des tubes coniques de 50 millilitres. Transférez le filtrat dans des tubes coniques de 50 millilitres et lavez les cellules quatre fois en faisant d’abord tourner les cellules à 50 G pendant une minute à quatre degrés Celsius. Une fois la cassure terminée, jetez soigneusement le surnageant, puis remettez la pastille en suspension dans du MEM froid et faites tourner à nouveau les cellules après le dernier lavage.

Remettre en suspension les cellules hépatiques dans le milieu de croissance. Ensemencez maintenant les cellules dans cinq à 10 flacons de culture tissulaire T 75 à une densité de 6,7 fois 10 à la quatrième cellule par centimètre carré. Placez les flacons de culture dans un incubateur et remplacez le milieu de culture tous les deux à trois jours.

Après une journée de culture, les hépatocytes parenchymateux se propagent à la surface du ballon et présentent une morphologie polygonale typique en forme de pierre de copal avec un ou deux noyaux ronds. En quelques jours de culture, les hépatocytes parenchymateux perdent leur morphologie cellulaire épithéliale et se transforment en cellules fibroblastiques plus aplaties Vers le sixième jour, des cellules rondes brillantes et brillantes comme des macrophages commencent à proliférer sur la feuille de cellules fibroblastiques. La croissance des cellules de type macrophage atteint des niveaux maximaux vers le 12e jour.

Le nombre de cellules de type macrophage diminue vers le 19e jour lorsque le feuillet cellulaire fibroblastique commence à dégénérer. Ainsi, autour de sept à dix jours de culture, nous suspendons les macrophages qui ont proliféré sur la feuille cellulaire dans le milieu de culture en secouant réciproquement les flacons de culture pendant 30 minutes après que les macrophages aient été remis en suspension. Jouez sur chacune des boîtes en plastique de 100 millimètres sans culture tissulaire avec le milieu de deux flacons T 75.

Remplissez les flacons de culture avec du milieu de culture et remettez-les dans l’incubateur. Incuber les plats en plastique pendant 30 minutes après la période d’incubation, laver les plats trois fois en aspirant le milieu et en rinçant doucement le plat en plastique avec du PBS comme on le voit ici dès 10 minutes après le placage des cellules ressemblant à des macrophages attachées à la surface du plat tandis que d’autres cellules fibroblastiques contaminantes restent en suspension. Après le rinçage au PBS, une population de macrophages hautement purifiés est obtenue.

Comme le montre cette figure, les cellules acquièrent une morphologie typique des macrophages après 40 minutes de culture et des cellules mitotiques sont fréquemment observées comme indiqué par les flèches. Pour recueillir cette nouvelle population de macrophages hautement purifiés à un millilitre de solution LE Express dans les cellules lavées et remettre les plats dans l’incubateur pendant 10 minutes supplémentaires. Après cette période d’incubation, ajoutez neuf millilitres de milieu de croissance, puis grattez doucement les macrophages attachés avec le grattoir cellulaire et transférez-les dans une centrifugeuse à tube conique de 15 millilitres et jetez le surnageant.

Ajouter un millilitre de milieu de croissance, dissocier les amas de cellules remises en suspension en cellules uniques par pipetage vigoureux, énumérer le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre comme le montre ce graphique, plus de 10 des six cellules peuvent être prélevées à plusieurs reprises dans un flacon de culture T 75 à deux à trois jours d’intervalle pendant plus de deux semaines, permettant un rendement total en cellules de 10 à sept par flacon de culture T 75. Comme le montrent ces images, les cellules isolées sont immuno-colorées avec des anticorps monoclonaux contre les antigènes des macrophages de rat tels que CD 68 ou ED one et CD 1 72 A ou OX 41. Ces cellules possédaient des propriétés fonctionnelles des macrophages telles que la phagocytose active des microbilles marquées au FITC.

Dans cette vidéo, nous avons présenté une méthode simple et efficace pour obtenir des macrophages à partir de cultures primaires mixtes de cellules hépatiques rouges adultes. Notre procédure ne nécessite pas d’équipement ou de compétences complexes, mais fournit un nombre suffisant de macrophages purs qui peuvent être récoltés à plusieurs reprises à partir de la même culture de laiton. Cette méthode peut être appliquée à d’autres espèces de mammifères.

Merci d’avoir regardé la vidéo et bonne chance dans vos futures expériences. À votre santé.