Détermination des profils d'expression génétique dans les C. elegans Utilisation microréseaux et PCR en temps réel

L’objectif général de cette procédure est d’étudier les profils d’expression génique sous-jacents à de nombreux phénotypes ou voies métaboliques. Pour ce faire, on isole d’abord l’ARNm de deux souches de nématodes contrastées. La deuxième étape de la procédure consiste à synthétiser des CD NA contenant des séquences de capture S, SI, trois ou SFI et à les hybrider en une puce à ADN.

La troisième étape de la procédure consiste à hybrider la puce avec des séquences anti-capture contenant S SI trois et SCIFI fluoro quatre. La dernière étape de la procédure consiste à scanner la puce et à analyser les données à l’aide d’outils bioinformatiques tels que le logiciel Magic Tool. En fin de compte, les gènes candidats médiateurs du phénomène biologique étudié sont identifiés et peuvent être validés et quantifiés par d’autres techniques telles que la PCR en temps réel.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car les nucléotides tachetés ne sont pas visibles pour l’utilisateur, de sorte qu’il est difficile de superposer un mélange d’hybridation homogène sur les plus de 23 000. Nucléotides imprimés de manière unique Commencez par collecter l’ARN de nématodes synchronisés sains. Tout d’abord, ils sont lavés et remis en suspension dans des tubes de 15 millilitres et les granulés de vers sont remis en suspension dans sept millilitres de chlorure de sodium de 0,1 molaire et sept millilitres de saccharose glacé, 60 % de poids par volume.

Après une incubation de 15 minutes sur glace, les vers sont à nouveau granulés. Maintenant, les vers exempts de bactéries vont remonter, sont collectés, lavés dans des ARN, de l’eau libre et granulés. Encore une fois, la pastille propre et légèrement compactée est transférée dans un micro-tube de centrifugation tourné vers le bas à vitesse maximale pendant 30 secondes.

Aspiré et stocké dans 10 volumes d’ARN, plus tard à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à continuer. Pour préparer des échantillons d’ARN total, centrifugez les pastilles préparées à la vitesse maximale, jetez le supernat et ajoutez une pincée de résine de broyage moléculaire à la pastille. Congelez ensuite le mélange à l’aide d’azote liquide à l’aide d’un pilon.

Broyez la suspension de vers de terre congelée en une poudre fine et de l’azote liquide au besoin pour garder la poudre froide après le broyage. Mettez l’extrait sur de la glace pendant cinq minutes. Après cinq minutes, mélangez l’extrait avec 700 microlitres de R-L-T-B-M-E et 472 microlitres de 100 % d’éthanol au total.

L’ARN peut maintenant être isolé à l’aide d’un kit disponible dans le commerce jusqu’à un volume final de 60 microlitres d’ARN isolé par échantillon biologique. Avant de procéder, éliminez la contamination potentielle de l’ADN génomique en traitant avec l’ADN un, suivi de l’utilisation d’une trousse de nettoyage de l’ARN disponible dans le commerce. Complétez le kit en faisant allusion à un volume de 60 microlitres.

Enfin, déterminez la concentration d’ARN et évaluez l’intégrité de l’ARN par un traitement avec un chargement d’échantillon de glyoxal, une analyse de colorant et de gel avant l’hybridation de microréseau. À l’aide de méthodes conventionnelles, l’ARN purifié est inversé transcrit en ADN complémentaire, qui est purifié à partir de la matrice dégradée avec un kit disponible dans le commerce et fait allusion à un volume de 60 microlitres. Commencez l’hybridation des microréseaux en bloquant l’élégance marine. Lames de microréseaux avec de l’ADN de spermatozoïde de saumon soniqué Après une heure, basculez les lames bloquées dans de l’eau distillée deux fois et faites-les tourner.

Séchez les lames dans des tubes coniques de 50 millilitres rembourrés d’une lingette kim. Préparez maintenant un tampon d’hybridation basé sur l’amide de forme deux x. Tout d’abord, réchauffez-le à 55 degrés Celsius pendant 10 minutes pour dissoudre complètement ses cristaux.

Ensuite, centrifugez-le pendant une minute à 10 000 g. Ensuite, mélangez 25 microlitres de CD NA avec 25 microlitres de tampon d’hybridation, et vaporisez doucement le mélange. Maintenant, faites tourner rapidement le mélange et incubez-le à 80 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Après l’incubation, pipetez soigneusement l’échantillon entier d’ADNC sur la lame de la puce sans toucher la lame. Pour répartir uniformément l’échantillon sur la lame de la puce. Abaissez doucement une lamelle sur la glissière à l’aide d’une aiguille de seringue avant que la lamelle ne soit complètement abaissée, tirez vers le haut et abaissez-la à nouveau avec l’aiguille pour permettre à la lamelle de se mettre doucement en place.

Cette technique minimise la formation de bulles d’air. Placez maintenant la lame horizontalement dans un tube conique de 50 millilitres sous la lame à 50 microlitres d’eau double distillée et laissez-la incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius le lendemain. Une deuxième hybridation est effectuée brièvement après le lavage de la lame.

À plusieurs reprises dans le SSC, le deuxième tampon, qui contient des réactifs de capture sensibles à la lumière et un réactif Antifa, est appliqué à l’aide de la même technique, suivie d’une courte incubation, d’autres lavages et d’un séchage. La diapositive peut ensuite être numérisée. Les images peuvent être analysées à l’aide d’un logiciel gratuit avec un outil magique open source.

Brièvement, sous l’onglet Projet, créez et enregistrez un nouveau projet sous l’onglet Profil d’expression de build, sélectionnez Charger la paire d’images et sélectionnez le fichier image rouge rouge et le fichier image vert vert. Sélectionnez ensuite l’onglet Profil d’expression de build. Choisissez load gene list pour télécharger un fichier de liste de gènes C elegance obtenu à partir du site Web du GCAT afin d’aborder et de quadriler l’image de la puce à ADN.

Sélectionnez l’onglet Profil d’expression de build et l’option Créer une grille de modification. Modifiez maintenant la grille. Configurez la boîte de dialogue en utilisant 48 pour le nombre de grilles, 22 lignes et 22 colonnes pour chaque grille et en choisissant de numéroter les points de gauche à droite et de haut en bas.

Augmentez le pourcentage de changement de contraste et zoomez sur la grille jusqu’à ce que les points individuels soient facilement distinguables. Créez les grilles en sélectionnant définir l’emplacement supérieur gauche dans le panneau de gauche, puis en cliquant sur le centre de l’emplacement supérieur gauche, suivi de l’emplacement supérieur droit et de la ligne inférieure de la première grille. Répétez cette procédure de quadrillage pour chacune des 48 grilles en procédant de gauche à droite et de haut en bas.

Enregistrez ensuite en sélectionnant l’onglet Fichier et enregistrez la grille actuelle telle qu’elle est une fois enregistrée. Sélectionnez l’onglet terminé pour éliminer tous les points non liés de l’analyse. Ouvrez l’onglet Profil d’expression de build et, sous l’option de grille d’adressage, sélectionnez Indicateur ponctuel.

Signalez maintenant les taches de traînée ou la fluorescence d’arrière-plan et enregistrez en sélectionnant Enregistrer les drapeaux actuels. Comme sous l’onglet fichier, les fichiers marqués doivent être segmentés. Enfin, analysez les gènes induits ou réprimés par un facteur spécifié en sélectionnant explorer sous l’onglet expression.

Dans la boîte de dialogue d’exploration, définissez les critères de correspondance des gènes fins. Le nombre de doubles augmente ou diminue dans l’expression. L’intensité est connue sous le nom de x et la valeur de X est le critère de changement d’expression.

X est entré sous une valeur maximale supérieure à X pour les gènes induits et une valeur minimale inférieure à x pour les gènes réprimés. Dans cette expérience, un contrôle d’échange de colorant est effectué les deux isolements indépendants d’ARN total des larves de stade trois et quatre sont hybridés en tant que mutant vert contre type sauvage rouge, tandis que le mutant rouge contre le type sauvage vert pour confirmer les changements d’expression génique font trois isolements indépendants d’ARN total en utilisant la même procédure synthétiser l’ADNC avec un kit disponible dans le commerce. et pour chaque échantillon de CD NA, effectuer une PCR en temps réel et tripler en utilisant trois gènes de ménage comme témoins. À des fins de démonstration, les résultats suivants examinent l’expression génique induite dans VSM one.

Les mutants AK 1468 sont une souche de nématode caractérisée par une synthèse renforcée avant d’effectuer l’analyse des microréseaux, la qualité de l’ARN extrait est vérifiée à l’aide de l’électrophorèse sur gel. La présence de deux sous-unités ribosomales intactes avant et après le traitement par dase one est indicative d’un bon échantillon d’ARN dans la puce à ADN sauvage : l’ADNC de type sauvage est marqué en rouge et le VSM un mutant CD NA est marqué en vert. Dans l’une des 48 grilles analysées par microréseau, chaque petit carré représente un seul oligonucléotide imprimé dans chaque réseau, chaque oligonucléotide unique est représenté.

Une fois que l’analyse par microréseau des transcrits isolés des larves de stade quatre montre que les gènes codant pour les principales protéines des spermatozoïdes ou MSP sont induits dans les mutants VSM un, l’analyse des microréseaux des larves de stade trois révèle également des changements d’expression au sein de la même famille de gènes chez le mutant. Test. Les prédictions de la puce à ADN par analyse PCR en temps réel révèlent qu’un membre de la famille du gène M ms P, MS P 32, est induit chez les mutants VSM one. Les données représentent la moyenne de trois répétitions de PCR en temps réel à partir de la même collection d’ARN.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de manipuler les outils bioinformatiques pour l’analyse à l’échelle du génome, d’autant plus qu’il existe de nombreux logiciels bioinformatiques open source à la disposition de la communauté scientifique.