Name: Détermination des profils dexpression génétique dans les C. elegans Utilisation microréseaux et PCR en temps réel (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Découvrez l'analyse de profils d'expression génique chez C. elegans par microréseaux et PCR en temps réel. Cette méthode permet d'identifier et valider des gènes candidats impliqués dans des phénomènes biologiques spécifiques.

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Ce travail a été réalisé par des étudiants de premier cycle à l&#39;Université d&#39;Oklahoma du sud-ouest d&#39;Etat, OK Weatherford. Ce travail a été soutenu par la NSF RUI-0963258, le NIH OK INBRE 2P20RR016478, GCAT et OCAST HR09-137S. Le vsm1 (ok1468) mutant a été isolé par le Consortium d&#39;Oklahoma inactivation du gène. Les auteurs remercient Dan Stefanovic et Tanner Wheeler pour leur aide précieuse lors de l&#39;exécution du projet.

<ol><li>Chai, A., Withers, J., Koh, Y. H., Parry, K., Bao, H., Zhang, B., Budnik, V., Pennetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hVAPB%2C+the+causative+gene+of+a+heterogeneous+group+of+motor+neuron+diseases+in+humans%2C+is+functionally+interchangeable+with+its+Drosophila+homologue+DVAP-33A+at+the+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">hVAPB, the causative gene of a heterogeneous group of motor neuron diseases in humans, is functionally interchangeable with its Drosophila homologue DVAP-33A at the Neuromuscular Junction.</a> Hum Mol Genet. 17, 266-280 (2008).</li>
<li>Tsuda, H., Han, S. M., Yang, Y., Tong, C., Lin, Y. Q., Mohan, K., Haueter, C., Zoghbi, A., Harati, Y., Kwan, J., Miller, M., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+8+protein+VAPB+is+cleaved%2C+secreted%2C+and+acts+as+a+ligand+for+Eph+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Amyotrophic Lateral Sclerosis 8 protein VAPB is cleaved, secreted, and acts as a ligand for Eph receptors.</a> Cell. 133, 963-977 (2008).</li>
<li>Dresbach, T., Torres, V., Wittenmayer, N., Altrock, W. D., Zamorano, P., Zuschratter, W., Nawrotzki, R., Ziv, N. E., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+Active+Zone+Precursor+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Assembly of Active Zone Precursor Vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 6038-6047 (2005).</li>
<li>Lustgarten, V., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+VSM1+Encodes+a+v-SNARE+Binding+Protein+That+May+Act+as+a+Negative+Regulator+of+Constitutive+Exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Yeast VSM1 Encodes a v-SNARE Binding Protein That May Act as a Negative Regulator of Constitutive Exocytosis.</a> Molecular and Cellular Biology. 19, 4480-4494 (1999).</li>
<li>Viñuela, A., Snoek, L., Riksen, J., Kammenga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Gene+Expression+Analysis+in+Response+to+Organophosphorous+Pesticide+Chlorpyrifos+and+Diazinon+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Gene Expression Analysis in Response to Organophosphorous Pesticide Chlorpyrifos and Diazinon in C. elegans.</a> PloS one. 5, 1-8 (2010).</li>
<li>Niwa, R., Hada, K., Moliyama, K., Ohniwa, R., Tan, Y., Olsson-Carter, K., Chi, W., Reinke, V., Slack, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+sym-1+is+downstream+target+of+the+hunchback-like-1+developmental+timing+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">elegans sym-1 is downstream target of the hunchback-like-1 developmental timing transcription factor.</a> Cell Cycle. 8, 4147-4154 (2009).</li>
<li>Kershner, A., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+targets+for+Caenorhabditis+elegans+FBF%2C+a+conserved+stem+cell+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA targets for Caenorhabditis elegans FBF, a conserved stem cell regulator.</a> PNAS. 107, 3963-3941 (2010).</li>
<li>Hammock, E., Eagleson, K., Barlow, S., Earls, L., Miller, D., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologs+of+genes+expressed+in+Caenorhabditis+elegans+GABAergic+neurons+are+also+found+in+the+developing+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Homologs of genes expressed in Caenorhabditis elegans GABAergic neurons are also found in the developing mouse forebrain.</a> Neural Development. 5, 1-14 (2010).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dans cette étude, nous avons développé un protocole simple à utiliser, convivial qui peut être utilisé pour déterminer les profils d&#39;expression génique qui sous-tendent divers phénomènes biologiques. Dans ce protocole, l&#39;ARN total a été isolé et traité en utilisant la DNase I. Notre méthode d&#39;isolement d&#39;ARN a été considérablement simplifiée par l&#39;omission des extractions phénol et en utilisant des résines d&#39;affinité pour nettoyer 5,6. Brièvement, C. elegans membranes cellulaires et la cuticule ont été fissurés par les nématodes ouvert la congélation à l&#39;azote liquide et le broyage de la résine moléculaire. Ensuite, l&#39;ARN extrait a été traité à la DNase I avant la synthèse d&#39;ADNc. L&#39;étape ultérieure a été ajouté afin de minimiser les hybridations non spécifiques; échantillons d&#39;ARN contaminés par l&#39;ADN génomique pourrait introduire des interférences et de produire de nombreux faux positifs. Puis, de type sauvage et VSM-1 (ok1468) ADNc mutant ont été marqués avec Cy3 et Cy5 séquences de capture et hybridé sur C. microarrays elegans obtenus par le programme GCAT. Ce système est plus sensible que des produits similaires, et ses deux couleurs de conception diminue le nombre de tableaux nécessaires, résultant en plus de temps et 7,8 coût-efficacité. De plus, ce système ne nécessite pas l&#39;équipement spécialisé d&#39;autres systèmes similaires, par conséquent, cette procédure pourrait être accompli dans n&#39;importe quel environnement de laboratoire standard 7. Troisièmement, les images fluorescentes array hybrides ont été analysés en utilisant le logiciel open source MAGICTool, et les profils d&#39;expression génique ont été créés. MAGICTool est un programme convivial qui est facilement utilisée par des personnes de tous niveaux d&#39;expérience, du baccalauréat au post-doctorat. Toutefois, la performance optimale nécessite la disponibilité de mémoire importante. Enfin, les gènes candidats obtenus en utilisant l&#39;analyse des microréseaux ont été validés avec PCR en temps réel. Bien que l&#39;approche génomique est une méthode efficace pour étudier des phénomènes biologiques, il ya quelques limitations on devrait prendre en considération. Premièrement, en dépit de la spécificité de ce protocole biopuces, les transcriptions sein d&#39;une famille sont indiscernables les uns des autres si l&#39;oligonucléotide imprimée est tirée de séquences conservées. PCR en temps réel compense les similitudes au sein d&#39;une famille de gènes et peut même distinguer entre les isoformes spécifiques d&#39;un même gène. Cependant, avec PCR en temps réel est un défi de trouver des contrôles vrai que s&#39;expriment aussi à travers la durée de vie d&#39;un organisme. Pour cette raison, les résultats seront relatives. Une approche protéomique est une alternative à notre technique. Protéines individuelles peuvent être isolées par électrophorèse en gel 2D et identifiés par spectrométrie de masse. Nos études montrent que spécifiquement nombreux membres de la protéine du sperme Major (MSP) de la famille sont induits dans VSM-1 nématodes mutants avec la densité synaptique accrue. MSP sont uniques à C. elegans et sont responsables de la maturation ovocytaire et l&#39;ovulation. Chai 1 a démontré que la régulation du nombre et la taille de bouton présynaptique de la jonction neuromusculaire chez la drosophile est probable contrôlées par des molécules contenant des domaines majeurs protéine du sperme. Des études menées par Tsuda et ses collègues ont démontré deux principaux domaines de protéine du sperme peut servir de ligands de récepteurs Ephrine, déclenchant des cascades de signalisation du récepteur tyrosine kinase. Par ailleurs, l&#39;analyse PCR en temps réel validé et rétrécie vers le bas les résultats de microréseaux pour un membre de la famille des MSP, MSP-32. Pris ensemble, le travail présenté ici constitue une analyse du génome entier d&#39;un dilemme central des neurosciences ainsi que la puissance de recherche de premier cycle dans l&#39;entreprise scientifique.

<table border="1"><tbody><tr><td> Composante </td><td> Catalogue # </td><td> Société </td></tr><tr><td> Plus tard, l&#39;ARN </td><td> AM7020 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> Molecular résine de broyage </td><td> 786-138 </td><td> Gbiosciences </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> 74104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Sans RNase agarose LE </td><td> AM9040 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> NorthernMax Gly 10X gel Prep / Tampon </td><td> 8678 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> ARN du Millénaire Marker </td><td> AM7150 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> Glyoxal chargement des échantillons Dye </td><td> 8551 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> DNase jeu </td><td> 79254 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RNeasy MinElute Kit </td><td> 74204 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RT enzymatique et Reaction Buffer 5X </td><td> RT300320 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> Tableau 350 </td><td> W300180 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> QIAquick PCR Purification </td><td> 28104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> 82021-4846 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Cisaillé l&#39;ADN de sperme de saumon </td><td> AM9680 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> Solution SDS </td><td> V6551 </td><td> Promega </td></tr><tr><td> TNT EM </td><td> 3860 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Kit iScript synthèse d&#39;ADNc </td><td> 170-8890 </td><td> BioRad </td></tr><tr><td> iQ SYBR Green Supermix </td><td> 170-8880 </td><td> BioRad </td></tr></tbody></table>

détermination des profils d&#39;expression génétique dans les c. elegans utilisation microréseaux et pcr en temps réel

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Les synapses sont composées d&#39;une zone présynaptique actif dans la signalisation cellulaire et un terminal postsynaptique dans la cellule cible. Dans le cas des synapses chimiques, les messages sont transportés par des neurotransmetteurs libérés à partir de terminaux présynaptiques et reçus par des récepteurs sur les cellules post-synaptiques. Nos recherches précédentes chez Caenorhabditis elegans ont montré que VSM-1 régule négativement l&#39;exocytose. De plus, l&#39;analyse de synapses dans VSM-1 mutants montré que les animaux manquent entièrement fonctionnelle connectivité VSM-1 ont augmenté synaptique. Basé sur ces résultats préliminaires, nous avons émis l&#39;hypothèse que C. elegans VSM-1 peut jouer un rôle crucial dans la synaptogenèse. Pour tester cette hypothèse, doublement marquée analyse microarray a été réalisée, et les profils d&#39;expression génique ont été déterminés. Premièrement, l&#39;ARN total a été isolé, inversement transcrit en ADNc et hybridé à l&#39;puces à ADN. Ensuite, l&#39;analyse in silico de l&#39;hybridation sonde fluorescente a révélé induction significative de nombreux gènes codant pour des membres de la famille des protéines du sperme majeure (MSP) en mutants avec synaptogenèse améliorée. MSP sont le principal composant du sperme en C. elegans et semblent signal de maturation ovocytaire et l&#39;ovulation nématodes. Dans les mouches à fruits, Chai et ses collègues ont démontré que 1 MSP-molécules réguler le numéro de bouton présynaptique et la taille à la jonction neuromusculaire. Par ailleurs, l&#39;analyse effectuée par Tsuda et ses collègues suggère que deux MSP peuvent agir comme des ligands de récepteurs Eph et déclencher des récepteurs tyrosine kinase cascades de signalisation. Enfin, l&#39;analyse PCR en temps réel corroboré que le gène codant pour MSP-32 est induite dans VSM-1 (ok1468) mutants. Pris ensemble, les recherches effectuées par notre laboratoire a montré que VSM-1 mutants ont une augmentation significative de la densité synaptique, qui pourraient être médiés par MSP-32 de signalisation.

L&#39;analyse par microréseau a été menée pour déterminer les profils d&#39;expression génétique dans<em&gt; C. elegans</em&gt;, Et PCR en temps réel a été utilisée pour valider et quantifier les données de biopuces.

Détermination des profils d&#39;expression génétique dans les C. elegans Utilisation microréseaux et PCR en temps réel

Les synapses sont composées d'une zone active présynaptique dans la cellule signalisante et d'une terminaison postsynaptique dans la cellule cible. Dans le cas des synapses chimiques, ...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier les profils d'expression génique sous-jacents à de nombreux phénotypes ou voies métaboliques. Cela est réalisé en premier lieu par l'isolement d'ARNm à partir de deux souches de nématodes contrastées. La deuxième étape de la procédure consiste à synthétiser de l'ADNc contenant soit des séquences de capture SSI trois, soit des séquences SFI, puis à les hybridiser à une puces à ADN.La troisième étape de la procédure consiste à hybridiser la puces à ADN avec des séquences anti-captures contenant S SI trois et SCIFI fluoro quatre. La dernière étape de la procédure est de scanner la puce à ADN et d'analyser les données à l'aide d'outils bioinformatiques tels que le logiciel magic tool. En fin de compte, les gènes candidats impliqués dans le phénomène biologique étudié sont identifiés et peuvent être validés et quantifiés par des techniques alternatives comme la PCR en temps réel.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés car les nucléotides imprimés ne sont pas visibles à l’utilisateur, ce qui rend difficile la superposition d’un mélange d’hybridation homogène sur les plus de 23 000 nucléotides. Commencez par extraire l’ARN de nématodes synchronisés sains. Tout d’abord, ils sont lavés, resuspendus dans des tubes de 15 millilitres, puis les culots de vers sont resuspendus dans sept millilitres de chlorure de sodium 0,1 molaire et sept millilitres de saccharose à 60 % poids par volume, glacé.Après une incubation de 15 minutes sur de la glace, les vers sont à nouveau mis en pellet. Les vers désormais exempts de bactéries remontent à la surface, sont collectés, lavés dans de l'eau exempte de RNAses et mis en pellet. Ensuite, le pellet propre et légèrement compacté est transféré dans un tube de microcentrifugeuse, puis centrifugé à vitesse maximale pendant 30 secondes.Aspirer et conserver dans 10 volumes de RNA later à quatre degrés Celsius jusqu'au moment de poursuivre. Pour préparer les échantillons d'ARN total, centrifuger les culots préparés à vitesse maximale, éliminer le surnageant et ajouter une pincée de résine de broyage moléculaire au culot. Ensuite, congeler le mélange à l'aide d'azote liquide en utilisant un pilon.Broyez la suspension de vers congelés en une fine poudre, en ajoutant de l'azote liquide au besoin pour maintenir la poudre au froid après le broyage. Placez l'extrait sur de la glace pendant cinq minutes. Au bout de cinq minutes, mélangez l'extrait avec 700 microlitres de R-L-T-B-M-E et 472 microlitres d'éthanol à 100 % au total.L'ARN peut désormais être isolé à l'aide d'un kit disponible dans le commerce, afin d'obtenir un volume final de 60 microlitres d'ARN isolé par échantillon biologique. Avant de poursuivre, éliminez toute contamination potentielle par l'ADN génomique en traitant avec DNAS one, puis utilisez un kit de purification de l'ARN disponible dans le commerce. Terminez la procédure en ajustant le volume à 60 microlitres.Enfin, déterminez la concentration en ARN et évaluez l'intégrité de l'ARN par traitement avec un chargement d'échantillon au glyoxal, coloration et analyse sur gel avant l'hybridation sur puces à ADN. À l'aide de méthodes classiques, l'ARN purifié est rétrotranscrit en ADN complémentaire, qui est ensuite purifié à partir du brin matrice dégradé à l'aide d'un kit disponible commercialement et ajusté à un volume de 60 microlitres. Commencez l'hybridation sur puce à ADN en bloquant l'élégance de mer. Incubez les lames de puces à ADN avec de l'ADN de sperme de saumon soniqué. Après une heure, plongez brièvement les lames bloquées dans de l'eau doublement distillée et faites-les centrifuger.Séchez les lames dans des tubes coniques de 50 millilitres rembourrés avec un essuie-tout Kim. Préparez maintenant un tampon d'hybridation à base de formamide deux fois concentré. Réchauffez-le d'abord à 55 degrés Celsius pendant 10 minutes afin de dissoudre complètement ses cristaux.Ensuite, centrifugez pendant une minute à 10 000 g. Puis, mélangez 25 microlitres d'ADN avec 25 microlitres de tampon d'hybridation, et agitez doucement le mélange. Effectuez maintenant une courte centrifugation du mélange et incubez-le à 80 degrés Celsius pendant 10 minutes.Après l'incubation, pipeter délicatement tout l'échantillon d'ADNc sur la lame de puces à ADN sans toucher la lame. Pour répartir uniformément l'échantillon sur la lame de puces à ADN, abaisser doucement une lamelle sur la lame à l'aide d'une aiguille de seringue ; avant que la lamelle ne soit complètement abaissée, la relever légèrement puis la redescendre à l'aide de l'aiguille, en permettant à la lamelle de se positionner en douceur.Cette technique minimise la formation de bulles d'air. Placez maintenant la lame horizontalement dans un tube conique de 50 millilitres en dessous de la lame avec 50 microlitres d'eau doublement distillée et laissez incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius le jour suivant. Une seconde hybridation est réalisée brièvement après lavage de la lame.Plusieurs fois dans le SSC, le deuxième tampon, qui contient des réactifs de capture sensibles à la lumière et un réactif Antifa, est appliqué en utilisant la même technique, suivi d'une courte incubation, de nouveaux lavages et d'un séchage. La lame peut ensuite être analysée par numérisation. Les images peuvent être analysées à l'aide du logiciel gratuit doté de l'outil open source magic.Brièvement, sous l'onglet projet, créez et enregistrez un nouveau projet dans l'onglet créer un profil d'expression, sélectionnez charger une paire d'images et attribuez le fichier image rouge comme rouge et le fichier image vert comme vert. Ensuite, sélectionnez l'onglet créer un profil d'expression. Choisissez charger une liste de gènes pour importer un fichier de liste de gènes de C. elegans obtenu à partir du site web GCAT afin de localiser et quadriller l'image de la puces à ADN.Sélectionnez l'onglet Profil d'expression de construction et l'option Créer une grille modifiable. Modifiez maintenant la grille. Configurez la boîte de dialogue avec 48 pour le nombre de grilles, 22 lignes et 22 colonnes pour chaque grille, et choisissez de numéroter les points de gauche à droite et de haut en bas.Augmentez le pourcentage de changement de contraste et zoomez sur la grille jusqu'à ce que les taches individuelles soient facilement distinguables. Créez les grilles en sélectionnant la tache supérieure gauche prédéfinie dans le panneau de gauche, puis en cliquant sur le centre de la tache supérieure gauche, suivie de la tache supérieure droite et de la rangée inférieure sur la grille un. Répétez cette procédure de quadrillage pour chacune des 48 grilles en procédant de gauche à droite et de haut en bas.Ensuite, enregistrez en sélectionnant l'onglet fichier et en choisissant d'enregistrer la grille actuelle. Sélectionnez l'onglet terminé pour éliminer toutes les taches non pertinentes de l'analyse. Ouvrez l'onglet créer le profil d'expression et, dans l'option de quadrillage par adressage, sélectionnez le marquage des taches.Signalez maintenant les colonies en stries ou la fluorescence de fond et enregistrez en sélectionnant « enregistrer les signalements actuels ». Comme dans l'onglet fichier, les fichiers signalés doivent être segmentés. Enfin, analysez les gènes induits ou réprimés par un facteur donné en sélectionnant « explorer » dans l'onglet expression.Dans la boîte de dialogue d'exploration, définissez les critères de correspondance pour les gènes précis. Le nombre d'augmentations ou de diminutions doubles de l'expression. L'intensité est désignée par x et la valeur de X constitue le critère de changement d'expression.X est saisi avec une valeur maximale supérieure à X pour les gènes induits et une valeur minimale inférieure à x pour les gènes réprimés. Dans cette expérience, un contrôle de permutation des colorants est effectué : deux isolations indépendantes d'ARN total à partir de larves au stade trois et au stade quatre sont hybridées soit en mutant vert par rapport au type sauvage rouge, soit en mutant rouge par rapport au type sauvage vert, afin de confirmer les variations d'expression génique. Réalisez trois isolations indépendantes d'ARN total en utilisant la même procédure, synthétisez l'ADNc à l'aide d'un kit disponible commercialement, puis effectuez pour chaque échantillon d'ADNc une PCR en temps réel en triplicat en utilisant trois gènes de référence comme témoins. À titre de démonstration, les résultats suivants examinent l'expression génique induite dans VSM un.Les mutants AK 1468 sont une souche de nématode caractérisée par une synapse renforcée. Avant d'effectuer l'analyse par puces à ADN, la qualité de l'ARN extrait est vérifiée par électrophorèse sur gel. La présence de deux sous-unités ribosomiques intactes avant et après un traitement à la RNase indique un bon échantillon d'ARN. Dans la puce à ADN, l'ADNc de type sauvage est marqué en rouge et l'ADNc du mutant VSM1 est marqué en vert. Sur cette grille, une des 48 analysées par puce à ADN, chaque petit carré représente un oligonucléotide unique imprimé ; dans chaque réseau, chaque oligonucléotide distinct est représenté.Une fois que l'analyse par puces à ADN des transcrits isolés à partir de larves au stade quatre montre que les gènes codant pour les protéines majeures du spermatozoïde ou MSP sont induits chez les mutants VSM one, l'analyse par puces à ADN de larves au stade trois révèle également des modifications d'expression au sein de la même famille génique chez le mutant. La vérification des prédictions issues de la puce à ADN par analyse en PCR en temps réel révèle qu'un membre de la famille génique M ms P, MS P 32, est induit chez les mutants VSM one. Les données représentent la moyenne de trois réplicats d'PCR en temps réel effectués à partir de la même collection d'ARN.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser des outils bioinformatiques pour l'analyse à l'échelle du génome, particulièrement en tenant compte du fait qu'il existe de nombreux logiciels bioinformatiques open source disponibles pour la communauté scientifique.

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