Enrichissement de phosphopeptides à base de dioxyde de titane : une méthode d’isolement sélectif de phosphopeptides à partir d’une bibliothèque de peptides

Les phosphopeptides sont de courtes chaînes d’acides aminés contenant des résidus phosphorylés de sérine, de thréonine ou de tyrosine. Pour isoler les phosphopeptides d’un mélange de peptides, commencez par prendre des billes de dioxyde de titane dans un tube. Équilibrer pour conditionner les billes à l’aide d’un tampon de liaison acidifié approprié contenant un agent de trempe. Ajoutez la concentration souhaitée de mélange de peptides à la boue de billes.

Incuber le mélange en secouant continuellement pour éviter que les billes ne se déposent. L’état acide favorise la formation de liaisons coordonnées avec le groupe phosphate des phosphopeptides avec les billes de titane. L’agent de trempe contenu dans le tampon réduit toute liaison non spécifique de peptides non phosphorylés aux billes, les laissant en suspension.

Centrifugeuse pour granuler les billes liées au phosphopeptide, tandis que les peptides non phosphorylés restent dans le surnageant. Jetez le surnageant. Transférez les billes liées au phosphopeptide dans une colonne de filtre de spin pré-assemblée. Centrifugeuse pour éliminer le tampon de liaison et piéger les billes conjuguées au phosphopeptide.

Transférez le filtre dans un tube propre et ajoutez une solution contenant de l’ammoniac. L’ammoniac rend la suspension basique, ce qui provoque le détachement des phosphopeptides des billes. Centrifuger l’ensemble pour éluer et recueillir les phosphopeptides non liés. Les billes de dioxyde de titane restent dans la cartouche filtrante. Séchez les phosphopeptides pour éliminer toute trace d’ammoniac.

Préconditionnez deux fois le dioxyde de titane avec 500 microlitres de 100 % d’ACN. Ensuite, conditionnez le dioxyde de titane avec 500 microlitres de tampon de phosphate de sodium 0,2 M, pH 7, deux fois. Enfin, utilisez 300 microlitres de tampon d’équilibrage pour laver les billes trois fois. Ajoutez 400 microlitres de 50 % d’ACN, 0,1 % de TFA dans le tube à faible liaison aux protéines. Ensuite, ajoutez 84 microlitres d’acide lactique.

Transférez les phosphopeptides remis en suspension dans le tube à faible liaison protéique et incuberez-les à température ambiante à l’aide d’un rotateur bout à bout pendant 1 heure. Après avoir granulé les billes, utilisez 300 microlitres de tampon d’équilibrage pour les laver deux fois et les essorer. Avec 300 microlitres de tampon de rinçage, rincez les billes deux fois. Ensuite, transférez-les dans un filtre de spin de 0,2 micromètre.

Après l’essorage, transférez l’unité de filtration dans un tube propre de 1,5 millilitre à faible teneur en protéines et, avec 200 microlitres d’ammonium à 0,9 % dans l’eau, éluez le contenu deux fois. Après avoir vérifié le pH, concentrez l’éluat sous vide pour qu’il soit sec pendant la nuit afin d’évaporer l’ammoniac.

• Phosphopeptides - Short strings of amino acids that contain phosphorylated residues.
• Titanium Dioxide Beads - Used to isolate phosphopeptides from a peptide mix.
• Peptide Mix - A mixture of peptides used in protein analysis and research.
• Phosphopeptide Enrichment Kits - Toolkits developed for isolating and enriching phosphopeptides.
• TFA Buffer - A solution used to stabilize pH, often used in biochemistry and molecular biology.

• Introduction to Phosphopeptides - Essential constituents in protein analysis and research (e.g., phosphopeptides).
• Usage of Titanium Dioxide Beads - They isolate phosphopeptides from a peptide mix (e.g., titanium phosphate).
• Role of Phosphopeptide Enrichment Kits - Helps isolate and enrich phosphopeptides (e.g., massprep phosphopeptide enrichment kits).
• Connection to Experiment – The process of isolating and enriching phosphopeptides is central to this study.

• What is the role of phosphopeptides in a peptide mixture?
• How do titanium dioxide beads help in isolating phosphopeptides?
• What is the purpose of phosphopeptide enrichment kits in this experiment?

• Description of Practical Applications – Isolating phosphopeptides has broad applications in protein analysis and research (e.g., peptide mix).
• Identification of Industry Impact – This process is beneficial in various sectors that heavily rely on biochemistry and molecular biology (e.g., healthcare).
• Highlighting Societal Importance – Having a deeper understanding of protein analysis and research paves the way for biological advancements (e.g., sustainability).
• Link to Scientific Advancements – The innovative techniques used to isolate phosphopeptides helps advance our understanding of proteins.