Name: Phosphopeptide Analyse des rongeurs spermatozoïdes épididymaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Découvrez l'analyse des phosphopeptides pour la biologie de la reproduction chez la souris. Cette méthode permet de quantifier les changements de phosphorylation lors de la maturation des spermatozoïdes épidi-dymaires.

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Les auteurs tiennent à remercier le NHMRC pour le prix de développement de carrière et les subventions APP1066336 qui ont soutenu ce travail.

1. Préparation de la Culture, des Médias et Plats <ol><li> Ajouter 200 ml d&#39;Biggers Whitten et Whitten (BWW) 17 solution de travail en ajoutant 5,54 g de NaCl, 0,356 g de KCl, 0,25 g de CaCl2, 0,162 g de H 2 KO 4 P et 0,294 g MgSO 4 à 1 L d&#39;eau Milli-Q . Ce est la solution de stock et peut être conservé à 4 ° C pendant jusqu&#39;à un mois. </li><li> De la solution de réserve, ajouter 420 mg de NaHCO 3 -, 200 mg de glucose, 6 pyruvate mg de sodium, 600 mg de sérum-albumine bovine, 0,74 lactate ml de sodium, et 4,0 ml de tampon HEPES à 193 ml du BWW stock. Ce est la solution de travail et se fait toujours fraîches le jour et équilibré à 37 ° C avant utilisation. </li><li> Pour faire la canule, prendre polyéthylène (PE) tubes d&#39;un diamètre intérieur de 0,4 mm et un diamètre externe de 1,1 mm et maintenez sur feu doux (généralement méthanol flamme) de telle sorte que le tube commence à fondre. Immédiatement retirer le tube outwARD se étirer et de faire le diamètre extérieur plus étroit. </li><li> Cut pour produire un rétrécissement d&#39;une extrémité qui permet de faciliter la canulation du canal déférent. </li><li> Couper l&#39;autre extrémité de la canule à environ 15 cm. Insérer une aiguille 30 G dans l&#39;extrémité émoussée, et joindre une seringue de 3 ml à elle (complètement rétractée). </li><li> Faire un embout d&#39;aspiration en coupant une longueur de 20 cm de tube PE (4,2 mm de diamètre intérieur, 6,4 mm de diamètre extérieur). Insérez une embouchure à une extrémité. </li><li> Insérer le support de tube de verre de micro-capillaire et le verre micro-capillaire lui-même (généralement 3 ul d&#39;une souris, 40 pi d&#39;un rat). </li></ol> 2. Retrait de l&#39;épididyme de souris <ol><li> Euthanasier les souris selon des procédures IACUC approuvés spécifiques à chaque institution. </li><li> Prenez l&#39;animal et faire une petite incision dans le scrotum pour exposer l&#39;épididyme. Tirez le testicule et l&#39;épididyme hors de la cavité à l&#39;aide d&#39;une paire de pince # 5 d&#39;horloger. </li><li> Couper les canaux déférents de sorte qu&#39;au moins 1-2 cm restent attachés à la queue de l&#39;épididyme. En outre, couper les canaux efférents proximales et tissus reliant les épididyme au testicule et retirer la totalité de la piste reproducteur masculin. </li><li> Placez la piste entière reproducteur masculin sous un microscope de dissection avec une plage de grossissement de l&#39;ordre de 5-40X. </li></ol> 3. cannulating l&#39;épididyme <ol><li> Ruban en bas de la canule de microscope, de telle sorte que 2.1 cm de l&#39;extrémité (en forme de cône) rétrécie est libre et visible à travers la lentille. </li><li> Prenez une paire de # 5 pinces d&#39;horloger et serrer doucement chaque côté du canal déférent et tirez le canal déférent sur la canule, de sorte que la canule va dans le canal déférent. </li><li> Prenez une longueur de non-absorbable tressé de soie noire traitée (taille 5-0) et faire un nœud autour des canaux déférents canule. Assurer le nœud est tiré étroitement pour maintenir la canule à l&#39;intérieur des canaux déférents lorsque la pression d&#39;air from la seringue est appliquée. </li></ol> 4. rétrograde ou Backflushing de Caudal spermatozoïdes épididymaires <ol><li> Utilisation horlogers # 5 pince, saisir l&#39;extrémité distale de l&#39;épididyme de cauda et enlever la tunique albuginée afin d&#39;exposer un seul tube de l&#39;épididyme. </li><li> Utilisation de la pince, tirez doucement sur le tube pour exposer puis démêler de manière à créer une ouverture pour le sperme d&#39;être libéré. </li><li> Poussez doucement sur les 3 ml (souris) ou 20 ml (rat) seringue pour expulser l&#39;air de la seringue dans le canal déférent. À la pression appropriée, les spermatozoïdes va commencer à revenir lentement sur le tubule brisée à l&#39;extrémité distale de la queue de l&#39;épididyme. A cette époque, appliquer une aspiration à l&#39;embouchure de tirer les spermatozoïdes dans le capillaire de verre. Remarque: En général, dans une souris, 2-3 ul de spermatozoïdes peut être obtenu en fonction de l&#39;âge de l&#39;animal. Une volonté de rat, le rendement moyen de 30 à 40 pi. </li></ol> 5. laveret la lyse des spermatozoïdes dans la préparation pour protéomique <ol><li> Expulser les spermatozoïdes dans le tube capillaire en verre dans 1 ml de solution de solution BWW (37 ° C) en soufflant doucement dans l&#39;embout ou la fixation d&#39;une seringue et d&#39;expulser de l&#39;air de manière à pousser les spermatozoïdes arrière du capillaire. </li><li> Une fois que les spermatozoïdes sont diffusés, laver 3x (300 g, 5 min) avec 1 ml BWW pour éliminer les protéines contaminantes. Après le lavage final, éliminer le surnageant. Remarque: À ce stade, les spermatozoïdes peuvent être congelés pour une utilisation ultérieure. </li><li> Solubiliser les protéines à l&#39;aide de 4% de CHAPS, 2 M, thio-urée et 50 mM de Tris, pH 7,4 pendant 1 h sous agitation en tourbillons intermittent. </li><li> Après la lyse des cellules, centrifugeuse (10 000 xg, 20 min), prendre surnageant et transférer dans un nouveau tube. Remarque: À ce stade, la quantification des protéines peut être effectuée. </li></ol> 6. disulfure réduction et alkylation <ol><li> Ajouter 10 mM de DTT comme une concentration finale de protéines lysées, vortex et incuber à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Ajouter 50 mM idodoacetamide comme une concentration finale de lysat, vortex et incuber à température ambiante pendant 30 min dans l&#39;obscurité. </li></ol> 7. Précipitation <ol><li> Le méthanol chloroforme précipiter l&#39;échantillon en ajoutant 1 volume de lysat (400 ul à titre d&#39;exemple), ajouter un volume (400 ul) de méthanol et 0,5 volume (200 ul) du chloroforme. </li><li> Vortex de l&#39;échantillon et de spin (10000 xg, 2 min). </li><li> Notez que deux phases apparaîtront après centrifugation. Jeter toutes, mais de 2 mm de la couche supérieure (en faisant attention de ne pas perturber l&#39;interface). </li><li> Ajouter 1 volume (400 pi) de méthanol, le tube inverti 1-2X doucement pour mélanger et encore tourner (10000 xg, 15 min). Rejeter le surnageant à perdre et l&#39;air culot sec 3-4 min. </li></ol> 8. digestion par la trypsine <ol><li> Reconstituer la trypsine dans 25 mM de bicarbonate d&#39;ammonium contenant 1 M d&#39;urée à un rapport de 50: 1 (poids / poids; teneur en protéines: la trypsine) et incubées overnight à 37 ° C, de préférence à 700 rpm sur un thermomixer. </li><li> Spin (10000 xg, 15 min) pour sédimenter matière non digérée. Transférer le surnageant dans un nouveau tube. </li></ol> 9. Phosphopeptide Enrichissement <ol><li> Effectuer la purification et l&#39;enrichissement de phosphopeptides du tryptique digérer comme décrit précédemment 18. Diluer peptides tryptiques 10 fois dans du tampon de DHB [DHB tampon se compose de: 350 mg / ml d&#39;acide 2,5 dihydrobenzesulfonic (DHB), 80% (v / v), ACN (acétonitrile), 2% (v / v) de TFA (trifluoroacétique l&#39;acide)] et se appliquent à sécher TiO 2 perles (200 ug). </li><li> Laisser un rotateur à la température ambiante pendant 1 heure. </li><li> Laver l&#39;échantillon avec un tampon de DHB, tourner et retirer surnageant. Laver ensuite l&#39;échantillon trois fois avec le tampon de lavage [80% ACN (v / v), 2% de TFA (v / v)] pour supprimer le DHB. </li><li> Après l&#39;essorage final, on élue directement les phosphopeptides en utilisant un tampon d&#39;élution par addition de 25 ul d&#39;un hydroxyde d&#39;ammonium à 2,5%, pH ≥ 10,5 solution. Sla broche et retirer le surnageant. Neutraliser immédiatement avec ~ 0,3 acide formique ul. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Les étapes critiques pour une analyse protéomique succès et reproductible des spermatozoïdes sont: 1) la pureté du produit de départ; 2) l&#39;élimination des sels et détergents non désirées; 3) la dénaturation des protéines dans leur intégralité, afin de permettre la trypsine pour digérer un rendement élevé de protéines et 4) réduisant au minimum la manipulation des échantillons pour réduire la perte de peptide. Pour Backflush succès la queue de l&#39;épididyme, il est essentiel de localiser la zone à partir de laquelle les spermatozoïdes se quitter. Dans le cas du rat et la souris, ce est au niveau du sommet de la zone concave, au milieu de la région caudale de l&#39;épididyme (voir la figure 2A). Si l&#39;on vient de plus vers le canal déférent, rinçage est plus facile et le taux de réussite est généralement plus élevé. Toutefois, cela vient de la perte de nombre de spermatozoïdes. Par ailleurs, si l&#39;on tente de déplacer plus proximale au corpus, le montant de la pression nécessaire pour pousser les spermatozoïdes à travers le epididymconduits AL est souvent si élevé, que les dommages à l&#39;épididyme se produit inévitablement. Rinçage à contre courant de l&#39;épididyme est traditionnellement réalisée en utilisant de l&#39;eau saturée de l&#39;huile minérale et une solution saline équilibrée dans la seringue elle-même comme milieu pour éliminer les spermatozoïdes 22-25. Les deux procédures sont potentiellement problématique de LC-MS. Tout d&#39;abord, minérale est susceptible de bloquer les nano-colonnes nano-C18 qui sont essentiellement utilisés dans le monde entier pour l&#39;analyse protéomique et les soins doivent être prises afin qu&#39;aucun est reporté dans la procédure. Si cela se produit, il est impossible de poursuivre et l&#39;échantillon est essentiellement perdu. Cela peut être surmonté par l&#39;utilisation de BWW ou d&#39;autres solutions salines équilibrées dans la seringue, cependant, bien que ce est un succès, nous avons vite reconnu que bon nombre des spermatozoïdes deviennent mobiles dès que la solution de BWW est entré en contact et mélangé avec le épididyme caudal cellules. Pour contourner ce problème, nous Backflush simplement les spermatozoïdes avec l&#39;air. Non seulement la quallité des spermatozoïdes comparable à celle des procédés en phase liquide, mais la quantité est identique. Phosphoprotéomique est peut-être l&#39;un des seuls moyens d&#39;établir des voies de signalisation qui se produisent dans les spermatozoïdes après l&#39;éjaculation. L&#39;une des principales voies que nous examinons est le processus de capacitation. Les spermatozoïdes doit subir &quot;capacitation&quot; avant qu&#39;il ne soit capable de se lier à un oeuf. Dans la pratique, ceci est réalisé essentiellement par incubation des spermatozoïdes pendant une période de temps (40 min souris, rat 1,5 h; h 24.3 humain) en solution BWW avec de l&#39;albumine sérique. Auparavant, nous et d&#39;autres avons montré un rôle pour plusieurs kinases impliquées dans la capacitation. D&#39;intérêt, la suppression de la PKA μ II produire des souris dont les spermatozoïdes nager spontanément in vitro, mais ne peut pas subir une hyperactivation 26. Cette dernière est une marque de capacitation, lequel spermatozoïdes à modifier leur modèle de natation d&#39;une grande vitesse, faible amplitude, à une faiblevitesse, grande amplitude fréquence de battement. Nous avons montré kinases en aval impliqués dans ce processus comprennent pp60-CSRC (SRC) 13,27 c-28 et oui c-ABL 14. Fait intéressant, l&#39;inhibition de la SRC se arrête capacitation dépendant phosphorylation sur tyrosine 13. Cependant, cela peut être surmonté avec de l&#39;acide okadaïque, ce qui suggère que la SRC ne est pas directement impliqué dans l&#39;apparition générale de la phosphorylation sur tyrosine 29 mais peut réglementer une phosphatase 29. Le problème avec l&#39;utilisation BWW comme un moyen de forcer les spermatozoïdes de l&#39;épididyme est que, une fois activé, les spermatozoïdes de souris seulement prendre environ 40 min à capacitation. Étant donné que l&#39;isolement des spermatozoïdes peut prendre 5 min / souris et souvent plusieurs souris sont utilisées dans une expérience, puis spermatozoïdes sera à différents stades de maturité au début de l&#39;expérience. Pour surmonter cela, la pression d&#39;air peut être utilisé pour pousser les spermatozoïdes de l&#39;épididyme caudal dans une canule de verre. Non seulement tout le inact de spermeIVE et essentiellement comme ils se trouvent dans le milieu caudale, il permet de comparer phosphoprotéomique non-mobiles et mobiles. Manutention pour phosphoprotéomique échantillon doit être maintenu à un minimum lorsque l&#39;on compare spermatozoïdes dans deux états fonctionnels différents. L&#39;utilisation de méthanol chloroforme sur les autres méthodes traditionnelles de précipitation des protéines 1) diminue la nécessité d&#39;étapes de lavage supplémentaires, 2) élimine presque toutes traces de sels et graisses et 3) a une capacité éprouvée pour précipiter les protéines de faible abondance sur 19 TCA. La précipitation des protéines avant la digestion par la trypsine est recommandée car non seulement cette aide à dénaturer la protéine (ce qui facilite la digestion de la trypsine), mais élimine la plupart des métabolites MS-incompatibles présents dans la cellule. La comparaison des phosphopeptides de sperme peut être fait dans un certain nombre de façons. Au niveau de base, une simple comparaison du phosphopeptide identifié dans un échantillon, à celle dans un autreéchantillon dans le processus connu sous le nom &quot;spectral counting&quot; peut être fait. Cependant la critique a été à cette démarche essentiellement parce que les études protéomiques début utilisaient faibles répétitions (pour une discussion plus approfondie voir Lundren et al. 30). Une approche plus sophistiquée consiste à examiner l&#39;intensité de la masse peptidique parente et comparer avec les autres échantillons (comparaison sans étiquette). Dans l&#39;exemple représenté sur la figure 4, un peptide de absents de la non mobile (figure 4 en haut) mais présente dans le motile (figure 4 en bas) de spermatozoïdes à partir de m / z de 650 à 670 peut être vu. Ce processus, appelé label-MS sans quantification est une stratégie sans étiquette. Une stratégie alternative couramment utilisée pour réduire la quantité de pistes nécessaires pour la quantification protéomique est d&#39;utiliser les isotopes. Comme la masse de l&#39;isotope est différent, le spectromètre de masse peut être utilisée pour comparer les intensités des Eluting peptides. Cependant, contrairement à la plupart des autres types de cellules, certains marquage isotopique ne peut pas être appliquée aux spermatozoïdes. Par exemple, l&#39;addition d&#39;isotopes stables (un isotope lourd est ajouté à un échantillon, tandis qu&#39;une version plus légère est ajoutée à l&#39;autre) peuvent être utilisés en culture tissulaire. Lorsque les isotopes se incorporés dans la protéine, une analyse protéomique peut être effectuée en combinant les deux échantillons (multiplexage). Toutefois, dans le cas de spermatozoïdes, ce ne est pas possible, simplement en vertu du fait que 1) marquage isotopique nécessite plusieurs passages (jusqu&#39;à 8) en culture tissulaire, et 2) les cellules de sperme n&#39;a aucune transcription des gènes nucléaires et de la traduction et, par conséquent, ils ne peuvent pas incorporer toute façon les isotopes dans toutes leurs protéines. Une façon de contourner cela est de commander des souris radiomarqués, cependant, ce sont notoirement coûteux. Une approche alternative est d&#39;utiliser une étiquette chimique. Cela a été fait lorsque les souris non capacitation ont été comparées avec des souris avec capacités. Dans ce cas, un D 0 et D un <sub&gt; 3 -label a été utilisé pour faire la distinction entre un échantillon et l&#39;autre dans le 31 spectromètre de masse. D&#39;autres approches peuvent inclure l&#39;utilisation de iTRAQ (TAG isobarique pour la quantification relative et absolue), lequel lysines sont étiquetés chimiquement avec différents isotopes de masse; iCAT (isotope codé balise d&#39;affinité) lequel cystéines sont étiquetés avec différents isotopes de masse et l&#39;étiquetage de l&#39;eau lourde et légère. Dans chaque cas, cependant, une chose doit être gardé à l&#39;esprit. Le MS ne signale que ce qui est présent dans un échantillon, et ce est un reflet de tout ce qui est arrivé à cet échantillon jusqu&#39;à ce point. Minimiser la manipulation des échantillons tout en maximisant le rendement à chaque étape est nécessaire pour une analyse protéomique succès.

Ayant émergé du testicule, les spermatozoïdes sont fortement différenciés mais remarquablement, ces cellules sont immatures 1,2. En tant que tel, ils ne ont pas une fonctionnalité complète, y compris la capacité de nager et se lier à un ovocyte 3. Bien que d&#39;autres maturation du spermatozoïde est nécessaire, ce ne peut avoir lieu par les voies canoniques, car à ce stade de leur processus de différenciation cellulaire, ils sont incapables de la transcription génique et encore la biosynthèse des protéines 4. La compétence biologique est conférée spermatozoïdes qu&#39;ils quittent le testicule et entrent dans une partie du système reproducteur mâle connu comme l&#39;épididyme 5. L&#39;épididyme est un tube enroulé étroitement, hautement différenciée qui relie les canaux efférents (du testicule) pour le canal déférent et est présent chez tous les mammifères mâles 6. Spermatozoïdes acquérir progressivement leur potentiel fertilisant pendant la descente de l&#39;épididyme, en se appuyant sur l&#39;environnement luminal en constante évolution qui est created par les cellules épithéliales de l&#39;épididyme locales 7. Les différentes activités de sécrétion et ré-absorption présents dans l&#39;acte de l&#39;épididyme milieu de modifier le sperme lui-même, changeant son protéines, glucides et lipides composition 6. L&#39;importance de l&#39;épididyme, en particulier la région initiale »habitant» de cette structure a été illustrée en utilisant des techniques chirurgicales de ligature 8. Spermatozoïdes retenu dans le testicule par efferent ligature du canal sont complètement défaut dans toute capacité à féconder l&#39;ovocyte 9-11. En plus de l&#39;environnement de l&#39;épididyme, les voies de transduction du signal au sein de l&#39;ouvrage de spermatozoïdes de manière post-traductionnelle de modifier le complément de la cellule de sperme existant. Par exemple, les spermatozoïdes depuis le début des régions de l&#39;épididyme afficher différents modèles de la phosphorylation des protéines par rapport à ces dernières régions 5,12. Ce ne est pas surprenant car il ya de grandes différences dans la capability des spermatozoïdes à partir de ces régions. Par exemple, les spermatozoïdes du début, habitant épididyme sont immotilite. En revanche, les cellules de sperme provenant de la région de cheval seront soumis avant la motilité progressive une fois placés dans un milieu isotonique. Comme les cellules de sperme de l&#39;épididyme sont incapables de novo la biosynthèse des protéines, toutes les voies intrinsèques réglementant la fonction des spermatozoïdes doivent être par des modifications post-traductionnelles (PTM). Par conséquent, il va de soi que la protéomique, et en particulier l&#39;enquête du PTM comme la phosphorylation doit être un axe majeur si nous voulons comprendre la maturation des cellules de sperme. Une autre méthode pour obtenir des spermatozoïdes epididymidies utiliser rétro-rinçant 13-16. Bien que cette technique est certainement plus de temps et prend un plus grand degré de compétence par l&#39;opérateur, les spermatozoïdes obtenu constamment démontrer pureté supérieure à 99,99%. En outre, contrairement à tous les autres techniques, les spermatozoïdes can être isolé dans un état de repos, ce qui permet d&#39;étudier comment la motilité des spermatozoïdes est lancé. Comme préparation de l&#39;échantillon est l&#39;aspect le plus important pour l&#39;analyse protéomique, l&#39;isolement des spermatozoïdes est devenu l&#39;un des aspects les plus importants des études de sperme-protéomique. Ce protocole fournit une explication sur la façon dont les spermatozoïdes sont isolés de la queue de l&#39;épididyme. Suite à cela, le TiO 2 phosphopeptide procédé d&#39;enrichissement est présenté, avec une référence spécifique sur la façon d&#39;extraire des peptides à partir des cellules de sperme très différenciés. L&#39;approche de MS peut être utilisée pour distinguer l&#39;évolution des phosphopeptides si l&#39;on devait comparer l&#39;épididyme spermatozoïdes caudale dans un État (immobiles ou non-capacitation) à un autre (mobiles, capacitation, acrosome réagi, etc.) ce qui en fait une approche puissante pour étudier spermatozoïdes fonction.

<table><tbody><tr><td>2,5-dihydroxy-1,4-benzoquinone</td><td>Aldrich</td><td>195464</td><td></td></tr><tr><td>Kit de quantification 2-D</td><td>VWR (GE Healthcare)</td><td>80-6483-56</td><td></td></tr><tr><td>Albumine de sérum bovin</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’ammoniac 25 %</td><td>Merck</td><td>1.05432</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate d’ammonium</td><td>Sigma</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td> <td>de calciumSigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate</td><td>Research Organics</td><td>1300C</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>BDH</td><td>10077.6B</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogénophosphate disodique</td><td>Merck</td><td>1.06580</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Acide formique</td><td>Sigma</td><td>O6440</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine-L</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (acide libre)</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Acide iodoacétique acide libre</td><td>Sigma</td><td>I4386</td><td></td></tr><tr><td>Acide lactique</td><td>Sigma</td><td>L1750</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Res. Org.</td><td>0090M</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Merck</td><td>10158.6B</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (stérile)</td><td>VWR (GE Healthcare)</td><td>GEHE17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la phosphatase Cocktail Halt</td><td>ThermoFisher Scientific (Pierce)</td><td>PIE78420</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogénocarbonate de potassium</td><td>Magasin médical</td><td>CH 600</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate</td><td>de sodium Sigma</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Dihydrogénophosphate de sodium</td><td>Merck</td><td>1.06346</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogénocarbonate de sodium</td><td>BDH</td><td>10247.4V</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Tris, qualité ultra pure</td><td>Amresco (Astral)</td><td>AM0497</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine Or, qualité de masse</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de zinc</td><td>Sigma</td><td>Z0173</td><td></td></tr><tr><td>0,4 mm Tube en polyéthylène</td><td>Goodfellow</td><td>ET317100</td><td></td></tr><tr><td>30 G Aiguille</td><td>Terumo</td><td>NN2038R</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Seringue</td><td>Terumo</td><td>SS035</td><td></td></tr><tr><td>Tube en polyéthylène 4,2 mm</td><td>Goodfellow</td><td>ET317640</td><td></td></tr><tr><td>Soie tressée (5-0)</td><td>Dynek</td><td>CSS0100</td><td></td></tr><tr><td>Acide trichloracétique</td><td>Sigma</td><td>299537</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 billes (de la colonne démontée)</td><td>Titansphere</td><td>6HT68003</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tube</td><td>Eppendorf 22431081</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C7B30</td><td>Sigma</td><td>C0856</td><td></td></tr></tbody></table>

phosphopeptide analyse des rongeurs spermatozoïdes épididymaires

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Les spermatozoïdes sont tout à fait unique parmi les types de cellules. Bien que produite dans les testicules, à la fois la transcription des gènes nucléaires et la traduction sont éteints fois la cuve ronde pré-curseur commence à se allonger et de se différencier dans ce qui est morphologiquement reconnu comme un spermatozoïde. Toutefois, le spermatozoïde est très immature, ne ayant aucune possibilité pour la motilité ou la reconnaissance d&#39;oeuf. Ces deux événements se produisent une fois le transit des spermatozoïdes un organe secondaire connu comme l&#39;épididyme. Pendant la journée, ~ 12 passage que cela prend pour une cellule de sperme de passer à travers l&#39;épididyme, les modifications post-traductionnelles des protéines existantes jouent un rôle essentiel dans la maturation de la cellule. Un aspect important de ce type est la phosphorylation des protéines. Afin de caractériser les événements de phosphorylation qui auront lieu pendant la maturation des spermatozoïdes, les deux populations de cellules de sperme purs et pré-fractionnement de phosphopeptides doivent être établies. Utilisation de retour techniques de chasse, une méthode pour l&#39;isolement de pur spermatozoïdes of haute qualité et le rendement de l&#39;épididyme distales ou caudale est décrite. Les étapes de solubilisation, la digestion et de pré-fractionnement de phosphopeptides de sperme par Chromatographie d&#39;affinité de TiO 2 sont expliqués. Une fois isolé, phosphopeptides peuvent être injectés dans MS pour identifier les deux événements de phosphorylation de protéines sur des résidus spécifiques d&#39;acides aminés et de quantifier les niveaux de phosphorylation qui se déroule au cours du processus de maturation des spermatozoïdes.

La qualité des résultats de toute analyse protéomique est fortement tributaire de la matière de départ. Avec MS modernes, de légères contaminations dans la préparation des échantillons sont facilement ramassés. Par conséquent, il est essentiel, dans le cas de la protéomique des cellules de sperme, de choisir une méthode qui donne des spermatozoïdes de haute pureté. Comme illustré sur la figure 1, rinçage rétrograde est utilisé pour récupérer les spermatozoïdes de l&#39;épididyme caudal. Cela implique cannulating le canal déférent avec tube PE qui permet d&#39;appliquer lentement la pression d&#39;air de la seringue attachée. Figure 1A démontre la queue de l&#39;épididyme avec les canaux déférents. Figure 1B est un gros plan de la façon dont le canal déférent est liée où le canule est insérée. Ce faisant, donc, les spermatozoïdes sont libérés à la fin excisé d&#39;un tubule des épididymes caudales. Comme le montre la Figure 2A, les spermatozoïdes sont extraits des régions sommet du Caudun épididyme et sont aspirés vers le haut dans un capillaire en verre dans un état ​​de repos (figure 2B). Cela présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes traditionnelles &quot;swim-up&quot;, et non le moindre, est la possibilité d&#39;effectuer une analyse phoshoproteomic des spermatozoïdes avant et après l&#39;activation de la motilité. Les spermatozoïdes peut alors être expulsé dans les médias de son choix. Figure 2C (côté gauche) montre comment le sperme regarder immédiatement après l&#39;expulsion en BWW médias. La plupart des cellules sont agglutinées. Cependant, après 10 min de la compétence des cellules est démontrée parce qu&#39;ils nagent à l&#39;homogénéité dans la solution (figure 2C, bonnes cellules de côté). Depuis la technique de rinçage a très peu d&#39;impact sur les spermatozoïdes, on obtient près de 100% de la motilité et les cellules se disperser rapidement dans les médias sans provocation externe. Dans une expérience typique de rinçage, le sperme récupéré de la Swiss-souris contiententre 5.1 x 10 6 cellules. Ce est très dépendante de l&#39;âge de l&#39;animal et peut varier de différentes souches de souris. Dans un Rat norvégien, on obtient généralement de 200 x 10 6 spermatozoïdes, ± 20%. La figure 2D représente la pureté de spermatozoïdes obtenu à partir de la queue de l&#39;épididyme du rat. Outre l&#39;échantillon lui-même, l&#39;une des principales questions concernant la préparation de l&#39;échantillon est le rendement de digestion par la trypsine. La précipitation des protéines joue un rôle majeur, non seulement pour éliminer les détergents et les sels indésirables, qui sont tous deux incompatibles avec MS, mais aussi dans la dénaturation des protéines. Nous avons trouvé le méthanol-chloroforme précipitations pour fonctionner au mieux. Non seulement cette procédure été rapporté pour précipiter faibles protéines abondantes mieux que d&#39;autres, y compris précipitation au TCA 19, mais il a des avantages supplémentaires. À la suite de précipitation au TCA, il est souvent nécessaire de réajuster le pH après la suspension de la pastille de TCA qui peut rester tout à faitacide. Bien que le culot précipité de TCA peut être lavé dans des solutions organiques élevées pour éliminer l&#39;acide, ce qui ajoute à la manipulation et reproductibilité des résultats de l&#39;échantillon. Le défaut de neutraliser l&#39;acide se traduira par des rendements pauvres peptidiques tryptiques. Le méthanol-chloroforme précipitation est non seulement rapide, mais ne sera pas acidifier l&#39;échantillon. La figure 3 illustre le culot de protéine habituellement vu de 100 ug d&#39;échantillon entre l&#39;interphase inférieur et supérieur. L&#39;isolement des phosphopeptides peut se produire dans un certain nombre de manières; cependant dépend de la reproductibilité de l&#39;échantillon a été traité jusqu&#39;à et y compris ce stade. Une des méthodes les plus courantes en développement est TiO 2, développé à l&#39;origine par le groupe de Martin Larsen 18,20,21. Bien que décrit comme un processus à utiliser dans microcolonnes, nous pouvons obtenir des données reproductibles en utilisant la chromatographie lot. Le succès du processus est fortement tributaire de la mémoire tampon d&#39;élution, qui doit être folle<html> e avec la composition correcte; autrement phosphopeptides ne sont pas élues à tous. La reproductibilité des données de protocole et représentatives de TiO 2 enrichi phosphopeptides de queue de l&#39;épididyme sperme dans un non-mobiles (Figure 4 en haut) et mobiles (Figure 4 en bas) état ​​de m / z 650 à 670 peut être vu. Nous avons démontré que ce est une technique extrêmement reproductible, même en utilisant 17 répétitions biologique. Les stries bleues apparaissant dans le temps sont des peptides se éluant à partir d&#39;une nano-colonne C18 en tant que la concentration d&#39;acétonitrile augmente. De toute évidence, dans la population mobiles (n = 3 montre, n = 8 de fonctionner normalement), il ya un groupe de peptide, avec une masse monoisotopique autour de la gamme Da 651,5 qui est totalement absent dans la gamme non mobiles. La spectrométrie de masse en tandem est ensuite utilisé pour identifier ce peptide. 546 / 51546fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figure 1:. Canulation de la queue de l&#39;épididyme (A) Image de la queue de l&#39;épididyme. La canule se est enregistrée pour exposer environ 1-2 cm de l&#39;extrémité pré-tiré. Ce est insérée dans le canal déférent à l&#39;aide de fines # 5watchmakers forceps. (B) La canule est maintenu en place en attachant soie fine autour d&#39;un segment contenant à la fois le canal déférent et la canule. De la souris, environ 2 à 3 pi de cellules de l&#39;épididyme caudal et on recueille le fluide à une concentration de 1 x 10 6 / ul. De le rat (illustré), environ 30-40 ul de fluide sont obtenus à des concentrations similaires. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig2highres.jpg" /> Figure 2: capillaire en verre utilisée pour recueillir des spermatozoïdes épididymaires compétente. (A) Un tube à partir du sommet de la queue e<html> pididymis est isolé et cassé. La position approximative à partir de laquelle cela se produit est montré. (B) Le haut de l&#39;image montre un tube capillaire en verre vide et le fond montre une d&#39;un rat préalablement rincé. Il n&#39;y a pas de contamination du sang et des cellules épithéliales contamination minime. (C) Comme les spermatozoïdes sont encore non dilué dans le fluide de l&#39;épididyme, ils ne ont pas commencé à se activer. Lorsque les spermatozoïdes sont initialement expulsé dans une solution de BWW, ils sortent comme une &quot;chaîne&quot; compact (côté gauche). La compétence de la cellule est facilement établie, puisque, après 10 minutes la plupart des spermatozoïdes nagent dans une solution sans aucune perturbation externe (côté droit). (D) Une image d&#39;une aliquote de cellules de l&#39;épididyme caudal immédiatement après qu&#39;ils ont été laissés à la nage montre sur la pureté des cellules. g3highres.jpg &quot;/&gt; Figure 3:. Méthanol-chloroforme précipitation fois que les spermatozoïdes ont été solubilisé, la fraction soluble est précipité méthanol-chloroforme pour assurer la dénaturation des protéines et l&#39;élimination des substances contaminantes. Le culot de protéine apparaît à l&#39;interface entre les phases de méthanol / eau et du chloroforme. La couche supérieure est retirée avec précaution afin de ne pas perturber cette pastille. Il est courant de laisser environ 3.2 mm de la phase supérieure ainsi que la protéine ne est perdue. <img alt="Figure 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig4highres.jpg" width="600" /> Figure 4:. Typique de TiO 2 enrichi en phosphopeptide de profil selon le protocole décrit, caudale spermatozoïdes épididymaires ont été isolés dans les deux immobiles (top, N = 3) ou mobiles états (en bas, N = 3). Un cluster de peptide avec une masse de mono-isotopique de ~ 651,5 Dun se révèle être présent dans les populations mobiles mais complètement absent dans celles immobiles (flèche). Les comparaisons de cette nature sont appelées &quot;(MS-fondé) sans étiquette&quot;. La masse peptidique et temps de rétention sont ensuite utilisés pour cibler le composé de la spectrométrie de masse en tandem et identifier la protéine à partir de laquelle le peptide a été dérivé.

L’analyse protéomique de tout type de cellule dépend fortement de la pureté et du pré-fractionnement du matériau de départ afin de décomplexifier l’échantillon avant la spectrométrie de masse (MS) par chromatographie en phase liquide. En utilisant des techniques de rinçage à contre-courant, des spermatozoïdes purs peuvent être obtenus à partir de rongeurs. Après digestion, les phosphopeptides peuvent être enrichis à l’aide de TiO2.

Phosphopeptide Analyse des rongeurs spermatozoïdes épididymaires

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de quantifier les modifications des peptides phospho­rylés qui surviennent dans les spermatozoïdes au cours de la maturation cellulaire spermatique. Cette opération est réalisée en prélevant l'épididyme caudal de la souris, en effectuant un lavage rétrograde des cellules spermatiques et en recueillant ces cellules dans un tube capillaire microscopique. Ensuite, les cellules spermatiques sont laissées en suspension dans une solution saline équilibrée afin de permettre l'élimination des protéines contaminantes, puis elles sont lavées, lysées et précipitées pour éliminer les sels et les lipides indésirables.Les protéines gulaires sont digérées à l’aide de trypsine, puis enrichies à l’aide de dioxyde de titane afin d’enrichir les peptides phospho. Les résultats montrent des changements quantitatifs dans l’état de phosphorylation des protéines, selon une analyse par chromatographie liquide et spectrométrie de masse. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie de la reproduction, telles que les modifications phosphoprotéomiques observées lorsque les spermatozoïdes traversent les EPI ou durant la capacitation.Bien que cette méthode ait permis d'obtenir des informations sur la biologie des cellules spermatiques, elle peut également être appliquée à des organismes modèles, à l'étude de maladies telles que le cancer, les pathologies neurologiques, ainsi qu'aux voies générales de transduction du signal. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car il est difficile de déterminer l'anatomie des régions dans lesquelles les EPI seront manipulés. Commencez par préparer 200 millilitres de solution working stock BWW (Biggers, Whitten et Whitten) en ajoutant les composants suivants à un litre d'eau Milli Q pour fabriquer une canule.Utiliser un tube en polyéthylène dont les diamètres interne et externe sont respectivement de 0,4 millimètre et de 1,1 millimètre. Tenir le tube au-dessus d'une faible chaleur jusqu'à ce que celui-ci commence à fondre. Tirer immédiatement sur les extrémités du tube vers l'extérieur pour l'étirer, réduisant ainsi le diamètre externe.Coupez le tube de manière à réduire le diamètre d'une extrémité, ce qui permettra une canulation plus facile du S deens. Coupez l'autre extrémité à environ 15 centimètres. Insérez ensuite une aiguille de calibre 30 dans l'extrémité émoussée et fixez-y une seringue de trois millilitres complètement rétractée.Préparez un embout buccal d'aspiration en coupant un morceau de tube PE de 20 centimètres de longueur et insérez-le dans une extrémité du cannule. Insérez le porte-capillaire en verre microscopique et le capillaire en verre microscopique. Après avoir euthanasié une souris conformément au protocole décrit, faites une petite incision dans le scrotum afin d'exposer l'épididyme.Ensuite, utilisez une pince de monteur de montres n°5 pour extraire les testicules et l'épididyme de la cavité. Coupez de manière à ne conserver qu'un à deux centimètres environ du canal déférent à partir de l'épididyme caudal.Ensuite, sectionner pour éliminer les conduits EENT proximaux et le tissu reliant l'épididyme au testicule, puis retirer l'ensemble de l'appareil reproducteur masculin au microscope stéréoscopique en utilisant un grossissement compris entre 5 x et 40 x. Placer un à deux centimètres de l'extrémité effilée de la canule dans le champ de vision et l'immobiliser à l'aide d'un ruban adhésif avec des pinces de bijoutier de taille cinq. Saisir délicatement chaque côté du canal déférent et le tirer par-dessus la partie visible de la canule.Ensuite, à l’aide d’une soie noire tressée traitée non absorbable, faire un nœud solide autour du tissu cannelé à l’aide d’une pince de bijoutier. Utiliser une pince numéro cinq. Saisir l’extrémité distale des kata epi ides et retirer la tunica Eugenia.Afin d'exposer un tubule épidermique unique, exposez délicatement le tubule et séparez-le pour créer une ouverture permettant la libération des spermatozoïdes. Ensuite, appuyez doucement sur le piston de la seringue pour expulser de l'air dans le canal déférent. La pression provoquera la sortie des spermatozoïdes du tubule rompu.Appliquez ensuite une aspiration sur l'embout buccal afin d'aspirer les spermatozoïdes dans la capillarité en verre. Soufflez doucement dans l'embout buccal ou fixez une seringue, puis expulsez les spermatozoïdes de la capillarité en verre dans un millilitre de solution WW préalablement chauffée. Utilisez cette solution pour laver les cellules trois fois afin d'éliminer les protéines contaminantes éventuelles.Après avoir éliminé le dernier lavage, congeler les spermatozoïdes pour une utilisation ultérieure ou utiliser 4 % de CHAPS, deux molarités de thio-urée et 50 millimolaires de Tris pH 7,4 pour solubiliser les protéines, puis incuber pendant une heure avec des vortexages intermittents. Ensuite, centrifuger la solution à 10 000 ×g pendant 20 minutes et transférer le surnageant dans un nouveau tube afin de réduire les ponts disulfure et alkylater les protéines avec du DTT à une concentration finale de 10 millimolaire dans la solution protéique. Vortexer et incuber à température ambiante pendant 30 minutes.Ensuite, ajoutez 50 millimolaire d'acétamide IO au lysat, vortexez et incubez pendant 30 minutes à température ambiante à l'abri de la lumière. Pour précipiter les protéines, mélangez un volume de lysat, un volume de méthanol et 0,5 volume de chloroforme. Après vortexage de l'échantillon, centrifugez à 10 000 Gs pendant deux minutes, puis récupérez la couche supérieure en laissant environ deux millimètres afin d'éviter d'aspirer l'interface.Après avoir ajouté un volume de méthanol, retourner doucement le tube et centrifuger à nouveau. Jeter le surnageant et sécher le culot à l'air pendant trois à quatre minutes afin de réaliser la digestion par la trypsine et l'enrichissement en peptides phospho. Commencer par utiliser du bicarbonate d'ammonium 25 millimolaire contenant de l'urée 1 molaire.Pour reconstituer la trypsine, associez le F 50 selon un rapport pondéral de un pour un entre la protéine et la trypsine, puis incubez toute la nuit dans un mélangeur thermique à 37 degrés Celsius et 700 tr/min. Après centrifugation pour former un culot du matériau non digéré, transférez le surnageant dans un nouveau tube. À l’aide du tampon DHB préparé conformément au protocole décrit, diluez dix fois les peptides trypsés et appliquez-les sur 200 microgrammes de billes sèches de dioxyde de titane ; incubez une heure à température ambiante sur un agitateur rotatif. Après l’incubation, rincez l’échantillon une fois supplémentaire avec le tampon DHB, puis rincez-le trois fois avec un tampon de lavage composé de 80 % ACN et de 2 % TFA. Après la dernière centrifugation, éluerez les peptides phospho en ajoutant immédiatement de l’hydroxyde d’ammonium à 2,5 % après centrifugation et récupération du surnageant.Utilisez 0,3 microlitre d'acide formique pour acidifier l'échantillon, comme illustré ici. Un avantage de ce protocole est que les spermatozoïdes sont isolés. À l'état quiescent, de nombreuses cellules s'agglomèrent juste après leur expulsion dans le milieu B WW.Cependant, après 10 minutes, ils deviennent modaux et la solution devient homogène. La préparation décrite dans cette vidéo produit généralement 200 fois 10 à la puissance 6 zoos. Ce graphique illustre la pureté des spermatozoïdes provenant de l'épididyme de rat AR Cota.Un problème majeur lié à la préparation des échantillons est le rendement des prélèvements et de la digestion. Contrairement à la précipitation par acide trichloroacétique (TCA), qui nécessite souvent un ajustement du pH de l'échantillon, la précipitation par phénol-chloroforme est rapide et n'acidifie pas l'échantillon ; ci-dessous figure le culot protéique typique obtenu à partir de 100 microgrammes d'échantillon, situé entre l'interface inférieure et supérieure illustrée. Voici la reproductibilité de ce protocole.Les stries bleues apparaissant au fil du temps sont des peptides éluant d'une colonne nano C18. Alors que la concentration d'acétonitrile augmente dans la population modale, on observe un regroupement de peptides d'environ 651,5 Daltons qui est totalement absent dans la plage non concernée. Une fois que le protocole d'enrichissement en peptides phosphatés est appliqué, il s'agit d'une technique efficace.Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que la préparation de l'échantillon est un aspect essentiel pour obtenir des résultats reproductibles en protéomique. Cette méthode peut être adaptée afin d'isoler les glycoprotéines, ce qui permet de répondre à d'autres questions, comme celles portant sur les protéines qui subissent un changement dans la teneur en acide sialique de leur protéome.

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Utilisation d'un analyseur de flux extracellulaire pour mesurer les changements dans la glycolyse et la phosphorylation oxydative pendant la capacitation de sperme de souris

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Enregistrement des courants électriques à travers la membrane plasmique des spermatozoïdes de mammifères

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Une approche basée sur la spectrométrie de masse pour identifier les phosphoprotéines phosphatases et leurs interacteurs

Le protocole présente une méthode pour isoler les lysats de protéines de cellules entières des processus faciaux d’embryons de souris disséqués ou de cellules de mésenchyme palatales embryonnaires de souris cultivées et effectuer un transfert occidental ultérieur pour évaluer les niveaux de protéines phosphorylées.

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Isolement par affinité chimique de vésicules extracellulaires à partir de biofluides pour l’analyse protéomique et phosphoprotéomique

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