Phosphopeptide Analyse des rongeurs spermatozoïdes épididymaires

L’objectif général de l’expérience suivante est de quantifier les changements du peptide phospho qui se produisent dans les spermatozoïdes pendant la maturation des spermatozoïdes. Ceci est réalisé en retirant le coddle épididyme de la souris, en effectuant un rinçage rétrograde des cellules de spermatozoïdes et en collectant les cellules dans un tube microcapillaire. Ensuite, les spermatozoïdes sont laissés nager dans une solution saline équilibrée, ce qui permet l’élimination des protéines contaminantes, puis ils sont lavés, lysés et précipités afin d’éliminer les sels et les graisses contaminants.

Les protéines gulaires sont digérées à l’aide de trypsine puis enrichies à l’aide de dioxyde de titane afin de les enrichir en peptides phospho. Les résultats montrent des changements quantitatifs dans l’état de phosphorylation des protéines basés sur la chromatographie liquide et l’analyse par spectrométrie de masse. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie de la reproduction, telles que : quels sont les changements phosphoprotéomiques lorsque les spermatozoïdes traversent les EPI ou pendant la capacitation.

Bien que cette méthode ait donné un aperçu de la biologie des spermatozoïdes, elle peut également être appliquée à des organismes modèles, à des études de maladies telles que le cancer, à des pathologies neurologiques et à des voies générales de transduction du signal. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car il est difficile de déterminer l’anatomie des zones dans lesquelles les EPI seront manipulés. Commencez par préparer 200 millilitres de solution de tige de travail Biggers, Whitten et Whitten ou BWW en ajoutant ce qui suit à un litre d’eau Milli Q pour faire une canule.

Utilisation de tubes en polyéthylène avec des diamètres intérieur et extérieur de 0,4 millimètre et 1,1 millimètre respectivement. Maintenez-le à feu doux jusqu’à ce que le tube commence à fondre. Tirez immédiatement les extrémités du tube vers l’extérieur pour l’étirer, diminuant ainsi le diamètre extérieur.

Coupez le tube pour produire un rétrécissement d’une extrémité, ce qui permettra une canulation plus facile des S. Coupez l’extrémité opposée à environ 15 centimètres. Insérez ensuite une aiguille de calibre 30 dans l’extrémité émoussée et fixez-y une seringue de trois millilitres complètement rétractée.

Fabriquez un embout buccal d’aspiration en coupant une longueur de 20 centimètres de tube en PE et insérez-le dans une extrémité de la canule. Insérez le support de tube en verre micro capillaire et le support de tube en verre micro capillaire. Après avoir euthanasié une souris selon le protocole textuel, faites une petite incision dans le scrotum pour exposer l’épi.

Faites ensuite appel à une paire d’horlogers. Numéro cinq forceps pour retirer le testicule et l’épididyme de la cavité. Coupez pour enlever tout sauf environ un à deux centimètres de la vaste déférence du kata épididyme.

Ensuite, coupez pour enlever les canaux EENT proximaux et le tissu reliant l’épididyme au testicule et retirez toute la piste reproductrice masculine sous un microscope de dissection en utilisant un grossissement entre cinq x et 40 x. Placez un à deux centimètres de l’extrémité rétrécie de la canule dans le champ de vision et fixez-la à l’aide d’un ruban adhésif à l’aide du numéro cinq, une pince d’horloger. Saisissez doucement chaque côté de la vaste déférence et tirez-la sur la partie visible de la canule.

Ensuite, avec de la soie traitée tressée noire non résorbable, faites un nœud sûr autour du tissu canulé à l’aide d’horlogers. Forceps numéro cinq. Saisissez l’extrémité distale du kata epi ides et retirez la tunique Eugenia.

Afin d’exposer un seul tubule épidermique, exposez doucement le tubule et séparez-le pour créer une ouverture pour que les spermatozoïdes soient libérés. Ensuite, appuyez doucement sur le piston de la seringue pour expulser l’air dans la vaste déférence. La pression provoquera la sortie des spermatozoïdes du tubule cassé.

Appliquez ensuite une aspiration sur l’embout buccal pour attirer les spermatozoïdes dans le capillaire en verre. Soufflez doucement dans l’embout buccal ou fixez une seringue et expulsez les spermatozoïdes du capillaire en verre dans un millilitre de solution B WW d’avant-guerre. Et utilisez la solution pour laver les cellules trois fois afin d’éliminer toutes les protéines contaminantes.

Après avoir retiré le lavage final, congelez le sperme pour une utilisation ultérieure ou utilisez des chaps à 4 %, deux molaires de thio urée et 50 millimolaires de tris pH 7,4 pour solubiliser les protéines incubées pendant une heure avec vortex intermittent. Ensuite, centrifugez la solution à 10 000 GS pendant 20 minutes et transférez le surnageant dans un nouveau tube pour réduire les liaisons disulfure et alkyler les protéines au DTT à une concentration finale de 10 millimolaires par rapport à la solution protéique. Vortex et incuber à température ambiante pendant 30 minutes.

Ajoutez ensuite 50 millimolaires d’IO acétamide dans le vortex de lysat et incubez pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Pour précipiter les protéines, combinez un volume de lysat, un volume de méthanol et 0,5 volume de chloroforme. Après avoir vortex l’échantillon, faites-le tourner à 10 000 Gs pendant deux minutes, récupérez la couche supérieure, en laissant environ deux millimètres pour éviter d’aspirer l’interface.

Après avoir ajouté un volume de méthanol, retournez doucement le tube et tournez à nouveau. Jetez le surnageant et séchez la pastille à l’air libre pendant trois à quatre minutes pour effectuer la trypsine, la digestion et l’enrichissement en peptide phospho. Commencez par utiliser du bicarbonate d’ammonium de 25 millimolaires contenant une urée molaire.

Pour reconstituer la trypsine, combinez F 50 à un rapport poids/poids de protéines à la trypsine et incubez sur un mélangeur thermique à 37 degrés Celsius et 700 tr/min pendant la nuit. Après avoir filé pour granuler la matière non digérée, transférez le surnageant dans un nouveau tube. À l’aide d’un tampon DHB préparé selon le protocole de texte, diluez dix fois les peptides inisés essayés et appliquez-le sur 200 microgrammes de billes de dioxyde de titane sèches, incubez sur un rotateur pendant une heure à température ambiante après l’incubation, utilisez le tampon DHB pour laver à nouveau l’échantillon avant d’utiliser un tampon de lavage composé de 80 % A de CN et de 2 % de TFA pour laver l’échantillon trois fois après la centrifugation finale. l’ajout de 2,5 % d’hydroxyde d’ammonium immédiatement après l’essorage et la collecte du surnageant.

Utilisez 0,3 microlitre d’acide formique pour acidifier l’échantillon, comme on le voit ici. L’un des avantages de ce protocole est que les spermatozoïdes sont isolés. Dans un état quiescent, de nombreuses cellules s’agglutinent juste après l’expulsion dans le milieu B WW.

Cependant, au bout de 10 minutes, ils deviennent moraux et la solution devient homogène. La préparation décrite dans cette vidéo produit généralement 200 fois 10 à six zoa. Cette figure démontre la pureté des spermatozoïdes du rat AR Cota epididymus.

L’un des principaux problèmes liés à la préparation des échantillons est le rendement des voyages et de la digestion. Contrairement à la précipitation TCA, qui nécessite souvent d’ajuster le pH de l’échantillon, la précipitation du phénol chloroforme est rapide et n’acidifie pas l’échantillon montré ici est la pastille de protéine généralement observée à partir de 100 microgrammes d’échantillon entre l’interface inférieure et supérieure démontrée. Voici la reproductibilité de ce protocole.

Les traînées bleues apparaissant au fil du temps sont des peptides faisant allusion à une nano-colonne de C 18. Au fur et à mesure que la concentration d’acétonitrile augmente dans la population modale, il existe un groupe de peptides à environ 651,5 Daltons qui est complètement absent dans la plage non indiquée. Une fois que le protocole d’enrichissement en peptides phosphates est une technique efficace.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que la préparation des échantillons est un aspect clé pour obtenir des résultats reproductibles pour la protéomique. Cette méthode peut être adaptée pour isoler les glycoprotéines, qui peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires telles que les protéines qui subissent un changement dans la teneur en acide sique de leur protéome.