Isolement des cryptes intestinales : une méthode pour isoler des cryptes entières de l’intestin grêle d’un modèle murin

La muqueuse intestinale est recouverte de saillies ou villosités et d’invaginations ou de cryptes. Les cryptes sont les glandes intestinales qui sécrètent principalement des enzymes digestives.

Pour isoler les cryptes de l’intestin grêle, commencez par positionner une souris anesthésiée en position couchée sur une planche de dissection. À l’aide de ciseaux, disséquez le péritoine longitudinalement pour exposer le système digestif.

Localisez l’intestin grêle et retirez-le doucement du corps de la souris. Coupez l’intestin à sa base. Transférez l’intestin prélevé dans une boîte contenant un tampon approprié. Coupez l’intestin longitudinalement, exposant la lumière.

Placez l’intestin, côté luminal vers le haut, sur une planche à découper pour exposer les villosités. Déplacez une lame de verre inclinée sur la surface intestinale pour gratter les villosités, exposant ainsi l’ensemble des cryptes.

Coupez l’intestin en petits morceaux et transférez-les dans un tube contenant un tampon glacé pour minimiser les dommages aux cryptes.

Ensuite, traitez avec de l’EDTA et incubez. L’EDTA provoque le détachement de toutes les cryptes de la muqueuse intestinale. Retirez la solution usée contenant de l’EDTA. Ajoutez un tampon frais et triturez à l’aide d’une pipette pour détacher les cryptes de la muqueuse intestinale.

Récupérez le surnageant contenant les cryptes dans un nouveau tube. Complétez le tube avec un milieu de culture approprié et centrifugez pour granuler les cryptes.

Disséquez le péritoine longitudinalement avec une paire de ciseaux. Tenez l’estomac avec la pince et coupez-le transversalement en deux à l’aide de ciseaux intestinaux à partir de ce moment. Retirez l’intestin et placez-le dans une boîte de Pétri contenant du PBS. Commencez par placer l’embout émoussé dans l’estomac et poussez-le doucement à travers le pylore.

Procédez en coupant avec les ciseaux et en tirant avec la pince. Une fois que tout l’intestin grêle est ouvert longitudinalement, lavez-le à froid dans du PBS en le tenant avec la pince et en le rinçant doucement dans la solution de PBS avec des mouvements en forme de U. Une fois que tous les restes de selles sont éliminés, procédez à l’aplatissement de l’intestin sur une planche à découper côté luminal vers le haut.

La face luminale est facilement reconnaissable par l’absence de vaisseaux sanguins et par son aspect pâle par rapport à la partie externe. À l’aide d’une lame de verre, retirez délicatement la villa en grattant l’intestin aplati. Effectuez cette étape deux fois sur toute la longueur du tissu. Ensuite, coupez l’intestin grêle avec une lame chirurgicale stérile en morceaux de 2 à 5 millimètres.

Placez les fragments de l’intestin grêle dans un tube de 50 millilitres contenant 10 millilitres de PBS glacé. Nettoyez les fragments de tissu en éliminant toutes les impuretés restantes en les pipetant de haut en bas dans le PBS. Jetez le surnageant et répétez cette étape jusqu’à ce que le PBS soit complètement clair. Ensuite, ajoutez 15 millilitres de PBS froid pour porter le volume final total de PBS à 25 millilitres. Ajouter 2 millimolaires d’EDTA et incuber pendant 45 minutes sur un rouleau à 4 degrés Celsius.

Après avoir jeté le PBS/EDTA, ajoutez 10 millilitres de PBS et détachez les cryptes en pipetant durement les fragments de tissu de haut en bas. Ensuite, récupérez le surnageant. Répétez l’étape quatre fois. Ajouter le milieu de culture pour atteindre un volume final de 50 millilitres. Granuler les cellules par centrifugation. Enfin, remettre la pastille en suspension dans 10 millilitres de milieu de culture avant de granuler les cryptes par centrifugation.