Isolement des vaisseaux cérébraux de souris : un protocole pour isoler les vaisseaux intacts d’un échantillon de cerveau murin

Les vaisseaux cérébraux sont entourés d’une couche de cellules endothéliales étroitement connectées. Ces cellules sont entourées d’une membrane basale ainsi que de composants cellulaires tels que les péricytes et les astrocytes.

Pour isoler les vaisseaux cérébraux des neurones et des cellules gliales environnants, prenez un bécher contenant du cerveau de souris immergé dans un tampon d’homogénéisation. Coupez-le en petits morceaux. Homogénéiser le tissu cérébral pour le dissocier, en libérant des neurones, des cellules gliales et des vaisseaux cérébraux. Ce traitement perturbe également la gaine de myéline entourant les neurones.

Transférez l’homogénat dans un tube et centrifugez-le pour granuler les récipients. Les composants plus légers, tels que les neurones et les cellules gliales, restent dans le surnageant, tandis que la myéline forme une couche d’interface dense entourant la cuillette.

Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille de vaisseau avec la couche de myéline attachée dans un milieu à gradient de densité approprié. Centrifuger pour granuler les vaisseaux et obtenir une bande de myéline riche en graisse flottant au sommet du surnageant. Retirez la bande de myéline ainsi que le milieu épuisé et remettez la pastille en suspension dans un tampon frais.

Filtrez la préparation du récipient brut à l’aide d’un ensemble de filtre contenant un filtre suffisamment petit pour que les récipients ne puissent pas le traverser. Transférez le filtre dans un bécher frais contenant une solution tampon. Grattez doucement le papier filtre pour détacher les récipients et rangez-les pour une analyse plus approfondie.

À l’aide d’un scalpel, incisez la peau du cou de la souris jusqu’au nez et tirez la peau vers l’arrière. Lavez le crâne avec du PBS pour éliminer tous les poils contaminants, puis insérez une paire de ciseaux dans le crâne, en avant des bulbes olfactifs. Ouvrez les ciseaux pour rompre le crâne en deux parties et retirez le cerveau avec une spatule.

Ensuite, disséquez le plexus choroïde des ventricules latéraux et transférez le cerveau dans un bécher de 150 millilitres contenant 20 millilitres de solution B1 sur de la glace. Ensuite, à l’aide de deux scalpels, hachez vigoureusement le cerveau en fragments de tissu de 2 millimètres et utilisez un homogénéisateur automatisé pour homogénéiser le tissu pendant 20 coups à 400 tr/min sur glace.

Pour purifier les vaisseaux, transférez l’homogénat dans un tube en plastique de 50 millilitres et faites tourner la boue tissulaire dans une centrifugeuse à rotor oscillant. Une grande interface blanche composée principalement de myéline se formera sur le dessus de la pastille vasculaire. Jetez le surnageant.

Ajoutez 20 millilitres de solution B2 glacée et secouez vigoureusement le tube pendant 1 minute. Après une seconde centrifugation, la myéline va former une couche blanche dense à la surface du surnageant. Faites pivoter lentement le tube pour permettre à la solution B2 de couler le long de la paroi pendant qu’elle est versée et jetez la myéline avec le surnageant.

Ensuite, utilisez une pipette en plastique enveloppée dans du papier absorbant pour éliminer tout liquide résiduel des parois du tube, en prenant soin de ne pas toucher la pastille du récipient, et retournez le tube sur de la glace. Ensuite, mettez à nouveau le granulé en suspension dans 1 millilitre de solution B3 glacée, suivi de l’ajout de 5 millilitres supplémentaires de solution B3, en veillant à ce que les récipients ne forment pas d’agrégats.

Maintenant, placez un filtre à mailles en nylon de 20 microns sur une fiole Becker et équilibrez le filtre avec 10 millilitres de solution B3 glacée. Versez la préparation du récipient sur le filtre et rincez soigneusement les récipients avec 40 millilitres supplémentaires de solution B3 glacée

Ensuite, à l’aide d’une pince propre, transférez immédiatement le filtre dans un bécher contenant 30 millilitres de solution B3 fraîche et fixez les récipients du filtre en secouant doucement. Versez le contenu du bécher dans un tube en plastique de 50 millilitres. Ensuite, après une centrifugation, remettre la pastille en suspension dans 1 millilitre de solution B3 glacée

• Brain vessels - Network of blood vessels supplying nutrients to the brain.
• Endothelial cells - Cells lining the interior surface of blood vessels.
• Homogenization buffer - Fluid used to break down cells for study purposes.
• Isolate - Separate one thing from everything else.
• Centrifuge - Machine that uses centrifugal force to separate different components of a fluid.

• Introduce Brain vessels - These are specialized structures responsible for nutrient transport (e.g., brain vessels).
• Key Concepts - Vessels are segregated from surrounding cells via homogenization and centrifugation.
• Underlying Mechanisms - Highlighting the role of density differences in separation.
• Connect to Experiment - The process of isolating brain vessels aligns with a broader context of neurobiology research.

• [Question 1] What are brain vessels and how to isolate them?
• [Question 2] What is the importance of homogenization buffer in isolation process?
• [Question 3] How does a centrifuge contribute to the isolation of brain vessels?

• Describe Practical Applications - Used in medical research for brain-related diseases (e.g., stroke, dementia).
• Industry Impact - Vital for pharmaceutical companies and suppliers of laboratory equipment.
• Societal Importance - It supports the understanding of brain disorders (e.g., Alzheimer’s).
• Link to Scientific Advancements - It has greatly improved with modern technologies and techniques.