Name: Isolement fiable des micronavires du système nerveux central dans cinq groupes de vertébrés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Découvrez une méthode fiable d'isolement des micronavires du système nerveux central chez cinq groupes de vertébrés. Cette technique rapide, sans ultracentrifugation, permet des études comparatives de la microvasculature cérébrale.

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Le Dr Cruz-Orengo a reçu le soutien de l'Université de Californie, Davis, School of Veterinary Medicine Start Up Funds.

<ol><li>Bundgaard, M., Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+vertebrates+started+out+with+a+glial+blood-brain+barrier+4-500+million+years+ago%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago.</a> Glia. 56, 699-708 (2008).</li>
<li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412(2015).</li>
<li>Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Clinical+Neurology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier.</a> Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).</li>
<li>Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+regulation+in+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders.</a> Neuroscience Letters. , (2018).</li>
<li>Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+brain+vasculature+in+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders.</a> Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).</li>
<li>Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-Brain+Barrier%3A+From+Physiology+to+Disease+and+Back%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back.</a> Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).</li>
<li>Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of the blood-brain barrier.</a> Tissue Barriers. 4, e1143544(2016).</li>
<li>O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+barriers%3A+a+comparative+look+at+the+blood-brain+barrier+across+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms.</a> Genes & Development. 32, 466-478 (2018).</li>
<li>Cruz-Orengo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR7+influences+leukocyte+entry+into+the+CNS+parenchyma+by+controlling+abluminal+CXCL12+abundance+during+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).</li>
<li>Serres, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VCAM-1-targeted+magnetic+resonance+imaging+reveals+subclinical+disease+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis.</a> FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).</li>
<li>Tietz, S., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+barriers%3A+Crosstalk+between+complex+tight+junctions+and+adherens+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions.</a> Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).</li>
<li>Sohet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LSR%2Fangulin-1+is+a+tricellular+tight+junction+protein+involved+in+blood-brain+barrier+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation.</a> Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).</li>
<li>Cruz-Orengo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sphingosine-1-phosphate+receptor+2+expression+underlies+female+CNS+autoimmunity+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility.</a> Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).</li>
<li>Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Straightforward+method+for+singularized+and+region-specific+CNS+microvessels+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).</li>
<li>Smyth, L. C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+for+human+brain+pericytes+and+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells.</a> Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).</li>
<li>Granberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+cortical+and+white+matter+neuroaxonal+pathology+in+early+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2912-2926 (2017).</li>
<li>Datta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation+and+its+relationship+to+changes+in+brain+volume+and+white+matter+lesions+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2927-2938 (2017).</li>
<li>Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimaging+Techniques+to+Assess+Inflammation+in+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis.</a> Neuroscience. 403, 4-16 (2019).</li>
<li>Liebner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+morphology+of+the+blood-brain+barrier+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).</li>
<li>Cornford, E., Hyman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+brain+endothelial+luminal+and+abluminal+transporters+with+immunogold+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy.</a> NeuroRx. 2, 27-43 (2005).</li>
<li>Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Mouse+Brain+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of Mouse Brain Vessels.</a> Journal of Visualized Experiments. , 53208(2015).</li>
<li>Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+3D+analysis+of+Claudin-5+reveals+significant+endothelial+heterogeneity+among+CNS+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels.</a> Microvascular Research. , (2012).</li>
<li>Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+digestion+improves+the+purity+of+harvested+cerebral+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels.</a> Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).</li>
<li>Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Research. 1134, 1-11 (2007).</li>
<li>Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-amyloid+pathology+in+human+brain+microvessel+extracts+from+the+parietal+cortex%3A+relation+with+cerebral+amyloid+angiopathy+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).</li>
<li>Porte, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+and+transcriptomic+study+of+brain+microvessels+in+neonatal+and+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice.</a> PLoS One. 12, e0171048(2017).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Le BBB comprend les propriétés uniques des cellules endothéliales microvasculature du cerveau couplées par une architecture sophistiquée de serré, adherens-, "peg-socket"- jonctions, et plaques d'adhérence critique pour l'homéostasie du SNC2,3,19. Les propriétés des cellules endothéliales sont induites et maintenues par les péritéytes et les processus d'astroglia environnants2,<sup class="xref"...

Notre cerveau est l'organe le plus important de notre corps. Pour cette raison, garder l'homéostasie du cerveau en dépit de facteurs externes qui peuvent déclencher une déviation de la normalité est une priorité. Selon certains chercheurs, il y a environ 400 à 500 millions d'années1, les animaux vertébrés ont développé ce que nous connaissons aujourd'hui comme la barrière hémato-encéphalique (BBB)2,3. Cette « clôture » protectrice exerce la plus grande influence sur l'homéostasie et les fonctions du système nerveux central (SNC) en régulant étroitement le transport des ions, des molécules et des cellules entre le sang et le parenchyme du SNC. Lorsque le BBB est perturbé, le cerveau devient sensible à l'exposition toxique, l'infection et l'inflammation. Par conséquent, le dysfonctionnement de BBB est associé à beaucoup, sinon tous, désordres neurologiques et neurodevelopmental4,5,6.
La fonction sophistiquée du BBB est attribuée à la microvasculature unique du SNC conforme par l'unité neurovasculaire (NVU)2,3. Les cellules endothéliales hautement spécialisées, les péricytes et les pieds d'extrémité astrocytiques sont les composants cellulaires du NVU2,3. La matrice extracellulaire générée par ces cellules est également essentielle à la physiologie NVU et BBB2,3. Bien que les composants cellulaires et moléculaires essentiels de la NVU soient conservés chez les vertébrés, l'hétérogénéité est signalée chez les ordres et les espèces7,8. Cependant, les limitations techniques entravent notre capacité à considérer pleinement ces différences dans la neurobiologie, la recherche biomédicale ou translationnelle.
Pour cette raison, nous avons élargi une méthode d'isolement micronavire spécifique à la région du SNC pour la rendre applicable à de nombreuses espèces des cinq groupes de vertébrés : poissons, amphibiens, reptiles, oiseaux et mammifères. Le protocole est décrit pour une utilisation sur les vertébrés de petite-lissencéphale et de grande gyrencéphalie, y compris les espèces avec la pertinence translationnelle9. En outre, nous incluons d'autres régions du SNC non étudiées auparavant dans ce contexte, mais pertinentes à la neurophysiologie et avec des implications cliniques énormes : l'hypothalamus, l'hypotuitaire et la matière blanche. Enfin, nous avons testé la capacité de cette méthode d'isolement comme un outil fiable pour identifier les changements dans l'expression des protéines le long de la NVU et / ou BBB9,10,11. Comme preuve de concept, nous avons montré comment déterminer les changements dans l'expression VCAM-1 et JAM-B pendant EAE utilisant la méthode d'isolement suivie de l'immunofluorescence.

<table><tbody><tr><td>10X PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>BP39920</td><td>Utilisé pour le blocage et le diluant d’anticorps.</td></tr><tr><td>20 % PFA</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15713-S</td><td>Utilisé comme fixateur (4 % PFA)</td></tr><tr><td>70 000 MW Dextran</td><td>Millipore Sigma</td><td>9004-54-0</td><td>Utilisé pour la solution MV-2</td></tr><tr><td>Adson Forceps</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11006-12</td><td>Utilisé pour l’ablation des muscles et de la peau</td></tr><tr><td>Adson Forceps, qualité étudiante</td><td>FST</td><td>91106-12</td><td>Identique que ci-dessus mais moins cher</td></tr><tr><td>Sérum bovin albumine (BSA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7906-100G</td><td>Utilisé pour la solution MV-3, le blocage et le diluant d’anticorps</td></tr><tr><td>Corning 100 &mu ; m Crépine à cellules</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS431752-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning 70 &mu ; m Filtre à cellules</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS431751-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning Deskwork pointes à faible liaison</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS4151</td><td>Identique que ci-dessous mais moins cher.</td></tr><tr><td>Cultrex Poly-D-Lysine</td><td>R& D</td><td>3439-100-01</td><td>Utilisé pour le revêtement en glissement</td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21432</td><td>Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.</td></tr><tr><td>Âne anti-souris IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A21202</td><td>Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.</td></tr><tr><td>Âne anti-Lapin IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A21206</td><td>Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.</td></tr><tr><td>Âne anti-Lapin IgG-ALEXA 647</td><td>Thermo</td><td>A31573</td><td>Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.</td></tr><tr><td>Âne anti-Rat IgG-DyLight 650</td><td>Thermo</td><td>SA5-10029</td><td>Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.</td></tr><tr><td>Pic à tissu à double broche</td><td>FST</td><td>18067-11</td><td>Utilisé pour l’ablation des méninges et du plexus choroïde</td></tr><tr><td>Dumont #3c Forceps</td><td>FST</td><td>11231-20</td><td>Utilisé pour la manipulation de tissus du SNC plus délicates et/ou plus petites (comme l’hypophyse)</td></tr><tr><td>Dumont #7 Forceps</td><td>FST</td><td>11274-20</td><td>Utilisé pour la dissection et la manipulation du syndrome du SNC</td></tr><tr><td>Dumont #7 Forceps, étudiant</td><td>FST</td><td>91197-00</td><td>Identique à ci-dessus mais </td></tr><tr><td>moins cher ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips</td><td>Eppendorf</td><td>22493008</td><td>de meilleure qualité que les tips ci-dessus (plus cher).</td></tr><tr><td>Pince Graefe extra fine, dentelée</td><td>FST</td><td>11151-10</td><td>Utilisée pour l’ablation des os</td></tr><tr><td>Ciseaux fins, tranchants</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td>Utilisée pour l’ablation du sac dural du porc et du macaque</td></tr><tr><td>Pilon en verre 1,5 mL Microcentrifuge Tube Broyeur de tissus Homogénéisateur, paquet de 10</td><td>Chang Bioscience Inc. (eBay)</td><td>GP1.5_10</td><td>Utilisé pour l’hypothale et l’hypophyse des petits vétébrés.</td></tr><tr><td>Anti-CXCL12 de chèvre,</td><td>PeproTech</td><td>500-P87BGBT</td> biotinylé <td>Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Dilution recommandée : 1:20.</td></tr><tr><td>Chèvre anti-JAM-B</td><td>R& D</td><td>AF1074</td><td>Utilisé comme anticorps primaire pour évaluer la neuroinflammation. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.</td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A11001</td><td>Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.</td></tr><tr><td>Anti-souris chèvre IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21424</td><td>Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.</td></tr><tr><td>Chèvre anti-PDGFR&beta ;</td><td>R& D</td><td>AF1042</td><td>Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.</td></tr><tr><td>Chèvre anti-Lapin IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21249</td><td>Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.</td></tr><tr><td>Chèvre anti-Lapin IgG-DyLight 488</td><td>Thermo</td><td>35552</td><td>Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.</td></tr><tr><td>Anti-Rat de chèvre IgG-DyLight 650</td><td>Thermo</td><td>SA5-10021</td><td>Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.</td></tr><tr><td>Pince Graefe, pointe incurvée, 1X2 dents</td><td>FST</td><td>11054-10</td><td>Utilisation pour le maintien et l’agitation des filets filtrants en nylon</td></tr><tr><td>HBSS, 1X tampon avec calcium et magnésium</td><td>Corning</td><td>21-022-CM</td><td>Utilisé pour la solution MV-1</td></tr><tr><td>HEPES, tampon liquide 1M</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td>Utilisé pour la solution MV-1</td></tr><tr><td>Isolectine GS-IB4-Biotin-XX</td><td>ThermoFisher Scientific (Thermo)</td><td>I21414</td><td>Glycoprotéine isolée de la légumineuse Griffonia simplicifolia qui se lie aux résidus D-galactosyle de la cellule endothéliale glycocalysx. Utilisé pour les microvaisseaux du SNC aviaire et porcin. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.</td></tr><tr><td>Ciseaux LaGrange, dentelés</td><td>FST</td><td>14173-12</td><td>Utilisé pour la dissection du crâne et la laminectomie (sauf porc et macaque)</td></tr><tr><td>Lame Millicell EZ unité 8 puits Millipore</td><td>Sigma</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti-CLDN5</td><td>Thermo</td><td>35-2500</td><td>Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC de tous les échantillons. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.</td></tr><tr><td>Souris anti-GGT1</td><td>Abcam</td><td>ab55138</td><td>Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.</td></tr><tr><td>Souris anti-humaine CD31</td><td>R& D</td><td>BBA7</td><td>Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC des primates. Concentration recommandée : 16,5 &mu ; g/mL.</td></tr><tr><td>Thermo</td><td></td><td>RMO-270</td><td>Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.</td></tr><tr><td>Souris anti-&alpha ;SMA</td><td>Thermo</td><td>MA5-11547</td><td>Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Dilution recommandée de 1:200.</td></tr><tr><td>Filet filtrant en nylon, rouleau</td><td>Millipore Sigma</td><td>NY6000010</td><td>Disques de filet filtrant découpés au laser à 13 mm de diamètre. Utilisé pour les petits hypothales et hypophysaires vétérés.</td></tr><tr><td>Filets filtrants en nylon, 25 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>NY2002500</td><td>Utilisé sur la plupart des tissus du SNC des petits vertébrés, à l’exception de l’hypothalamus et de l’hypophyse. Utilisé pour l’hypothalamus et l’hypophyse du macaque et du porc.</td></tr><tr><td>Filets filtrants en nylon, 47 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>NY2004700</td><td>Utilisé pour les tissus du SNC des macaques et des porcs, à l’exception de l’hypothalamus et de l’hypophyse.</td></tr><tr><td>Réactif anti-décoloration ProLong Gold avec DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>P36935</td><td>Utilisé pour les lames de lamelles.</td></tr><tr><td>Lapin anti-AQP4</td><td>Millipore Sigma</td><td>A5971</td><td>Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Dilution recommandée de 1:200.</td></tr><tr><td>Lapin anti-LSR</td><td>Millipore Sigma</td><td>SAB2107967</td><td>Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.</td></tr><tr><td>Lapin anti-NG2</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB5320</td><td>Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Dilution recommandée de 1:200.</td></tr><tr><td>Lapin anti-OSP</td><td>Abcam</td><td>ab53041</td><td>Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Concentration recommandée : 1 &mu ; g/mL.</td></tr><tr><td>Lapin anti-VE-Cadhérine</td><td>Abcam</td><td>ab33168</td><td>Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.</td></tr><tr><td>Lapin anti-ZO-1</td><td>Thermo</td><td>61-7300</td><td>Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.</td></tr><tr><td>Rat anti-CD31</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 550274</td><td>Utilisé comme anticorps primaire pour les microvaisseaux murins du SNC. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.</td></tr><tr><td>Anti-GFAP pour rat</td><td>Thermo</td><td>13-0300</td><td>Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Dilution recommandée de 1:200.</td></tr><tr><td>Rat anti-VCAM-1</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 553329</td><td>Utilisé comme anticorps primaire pour évaluer la neuroinflammation. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.</td></tr><tr><td>Solution de Ringer stérile, Frog</td><td>Aldon Corporation</td><td>IS5066</td><td>Utilisé pour l’anesthésie amfibienne</td></tr><tr><td>Streptavidin-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>S32355</td><td>Utilisé comme anticorps secondaire pour marquer les anticorps primaires biotinylés. Dilution recommandée de 1:500.</td></tr><tr><td>Streptavidin-ALEXA 647</td><td>Thermo</td><td>S32357</td><td>Utilisé comme anticorps secondaire pour marquer les anticorps primaires biotinylés. Dilution recommandée de 1:500.</td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux, tranchants</td><td>FST</td><td>14002-12</td><td>Utilisés pour l’ablation des muscles et de la peau</td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux, tranchants-émoussés</td><td>FST</td><td>14001-16</td><td>Utilisés pour la décapitation (sauf porc et macaque)</td></tr><tr><td>Porte-filtre Swinnex, 13 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0001300</td><td>Modifié par découpe laser. Utilisé pour les petits hypothales et hypophysaires vétérés.</td></tr><tr><td>Porte-filtre Swinnex, 25 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0002500</td><td>Modifié par découpe laser. Utilisé sur la plupart des tissus du SNC des petits vertébrés, à l’exception de l’hypothalamus et de l’hypophyse. Utilisé pour l’hypothalamus et l’hypophyse du macaque et du porc.</td></tr><tr><td>Porte-filtre Swinnex, 47 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0004700</td><td>Modifié par découpe laser. Utilisé pour les tissus du SNC du macaque et du porc, à l’exception de l’hypothalamus et de l’hypophyse.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher</td><td>50-165-7277</td><td>Utilisé pour le blocage et le diluant d’anticorps.</td></tr><tr><td>Wheaton 120 Vac Overhead Sutterrer</td><td>VWR (Fournisseur DWK Life Sciences)</td><td>62400-904 (DWK #903475)</td><td>Utilisé pour les tissus du SNC du macaque et du porc avec un broyeur de tissus de 55 ml, à l’exception de l’hypothalamus et de l’hypophyse.</td></tr><tr><td>Broyeur de tissus Wheaton Potter-Elvehjem avec pilon en PTFE, 10 mL</td><td>VWR (Fournisseur DWK Life Sciences)</td><td>14231-384 (DWK #357979)</td><td>Utilisé sur la plupart des tissus du SNC des petits vertébrés, à l’exception de l’hypothalamus et de l’hypophyse. Utilisé pour l’hypothalamus et l’hypophyse du macaque et du porc.</td></tr><tr><td>Broyeur de tissus Wheaton Potter-Elvehjem avec pilon en PTFE, 55 mL</td><td>VWR (Fournisseur DWK Life Sciences)</td><td>14231-372 (DWK #357994)</td><td>Utilisé pour les tissus du SNC du macaque et du porc, à l’exception de l’hypothalamus et de l’hypophyse.</td></tr></tbody></table>

isolement fiable des micronavires du système nerveux central dans cinq groupes de vertébrés

Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

L'isolement des microvaisseaux du système nerveux central (SNC) est généralement effectué en combinant le tissu cortical de plusieurs animaux, le plus souvent des rongeurs. Cette approche limite l'interrogation des propriétés de la barrière hémato-encéphalique (BBB) au cortex et ne permet pas de comparaison individuelle. Ce projet se concentre sur le développement d'une méthode d'isolement qui permet la comparaison de l'unité neurovasculaire (NVU) à partir de plusieurs régions du SNC : cortex, cervelet, lobe optique, hypothalamus, pituitaire, tronc cérébral et moelle épinière. En outre, ce protocole, initialement développé pour les échantillons de murine, a été adapté avec succès pour une utilisation sur les tissus du SNC à partir de petites et grandes espèces de vertébrés à partir de laquelle nous sommes également en mesure d'isoler les micronavires de la matière blanche de l'hémisphère cérébral. Cette méthode, lorsqu'elle est jumelée à l'immunolabeling, permet la quantitation de l'expression des protéines et la comparaison statistique entre les individus, le type de tissu ou le traitement. Nous avons prouvé cette applicabilité en évaluant des changements dans l'expression de protéine pendant l'encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE), un modèle murine d'une maladie neuroinflammatoire, sclérose en plaques. En outre, les micronavires isolés par cette méthode pourraient être utilisés pour des applications en aval comme qPCR, RNA-seq, et Western blot, entre autres. Même s'il ne s'agit pas de la première tentative d'isoler les micronavires du SNC sans l'utilisation d'ultracentrifugation ou de dissociation enzymatique, il est unique dans son aptitude à la comparaison des individus isolés et de plusieurs régions du SNC. Par conséquent, il permet d'enquêter sur une gamme de différences qui pourraient autrement rester obscures : parties du SNC (cortex, cervelet, lobe optique, tronc cérébral, hypothalamus, pituitaire et moelle épinière), type tissu du SNC (matière grise ou blanche), individus, groupes de traitement expérimental et des espèces.

Les microvessels isolés du SNC murine ont montré tous les composants cellulaires intrinsèques de l'unité neurovasculaire2,3. Utilisation de la molécule d'adhérence des cellules endothéliales plaquettaires-1 (PECAM, également connue sous le nom de CD31) ou de l'isolectin IB4 (une glycoprotéine qui lie la cellule endothéliale glycocalyx) pour les cellules endothéliales, Le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFTRD) ou ant...

Le but de ce protocole est d'isoler les micronavires de plusieurs régions du système nerveux central des vertébrés lissencephalic et gyrencephalic.

Isolement fiable des micronavires du système nerveux central dans cinq groupes de vertébrés

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...

Ce protocole est significatif parce qu’il permet la comparaison de la microvasculature entre différentes régions du système nerveux central, ainsi qu’entre différents individus. Cette technique d’isolation des microvétiles peut être complétée en une seule journée, et elle élimine le besoin d’ultracentrifugation et de dissociation enzymatique. Enlever les méninges et le plexus choroïde peut être difficile.Assurez-vous de travailler lentement et soigneusement pour assurer l’ablation complète de chaque tissu. Pour la dissection tissulaire du SNC à partir d’un petit spécimen de vertébrés lissencéphales, placez le cerveau récolté dans un tube conique de 15 millilitres contenant la solution MV-1 sur la glace, et utilisez des forceps pour récupérer l’hypophyse de la sella turcica du crâne. Placez l’hypophyse dans un tube de microcentrifugeuse de 1,7 millilitre de solution MV-1 sur la glace, et retirez la peau et le muscle pour exposer la colonne vertébrale.Après avoir enlevé les membres, la cage thoracique et les organes internes, utilisez une seringue de 10 millilitres munie d’une aiguille de calibre 18 pour rincer la colonne vertébrale avec une solution MV-1 fraîche, dans une direction caudale à rostrale dans tout le contre-courant vertébral lombaire. Placez ensuite la moelle épinière dans un tube de 5 millilitres contenant une solution MV-1 fraîche. Ensuite, placez le cerveau dans une boîte de Pétri sous le microscope disséquant, et retirez les méninges avec la piqûre à double proue.Assurez-vous de vérifier la moelle épinière pour vous assurer qu’il ne reste plus de méninges. Utilisez les forceps pour séparer l’hypothalamus, le cervelet, le tronc cérébral et le cortex. Si nécessaire, utilisez des forceps et des ciseaux d’iris et de ressort pour exciser les bulbes olfactifs et le thalamus, et utilisez la piqûre à double proue pour enlever tout le plexus choroïde de tous les ventricules du cerveau.Pour la dissection tissulaire du SNC à partir d’un grand spécimen de vertébrés gyrencéphales, utilisez un microscope disséqué et une piqûre à double proue, des forceps et des ciseaux d’iris et de ressort pour enlever les méninges de chaque tissu du SNC, en prenant soin d’enlever tout plexus choroïde des ventricules cérébraux. Pour l’homogénéisation des tissus du SNC récoltés, hacher chaque région du SNC en morceaux d’un à deux millimètres dans des boîtes de Pétri individuelles. Pour homogénéiser les tissus du SNC à partir de petits spécimens de vertébrés, utilisez une pipette de transfert pour ajouter un millilitre de solution MV-1 pour suspendre le tissu haché.Utilisez ensuite la même pipette de transfert pour distribuer le cortex, le cervelet, le tronc cérébral, le lobe optique et les morceaux de moelle épinière en broyeurs individuels de tissu de verre de 10 millilitres, et utilisez un pilon PTFE et cinq millilitres de solution MV-1 pour moudre chaque ensemble de tissus pendant environ 10 coups. Transférez chaque boue tissulaire dans des tubes coniques individuels de 15 millilitres sur la glace, et utilisez des forceps pour placer l’hypothalamus et l’hypophyse dans 100 microlitres de solution MV-1, dans des tubes individuels de 1,7 millilitre. Ensuite, homogénéisez soigneusement chaque tissu à l’aide d’un micropestre en verre.Pour homogénéiser un grand spécimen de vertébrés, utilisez une pipette de transfert coupée biseauté pour transférer le tissu haché dans un broyeur de tissu en verre de 55 millilitres et fixez le broyeur à un agitateur aérien. Ajouter la moitié du volume recommandé de solution MV-1 en fonction de l’homogénéisation de la partie spécifique du SNC indiquée dans le tableau et activer l’agitateur supérieur à environ 150 rotations par minute. Déplacez soigneusement le tube de verre de haut en bas pendant environ 30 secondes avant d’éteindre l’agitateur supérieur pour ajouter plus de solution MV-1 pour une homogénéisation supplémentaire, jusqu’à ce qu’une boue homogène soit obtenue.Transférer ensuite le tissu homogénéisé dans un tube conique de 50 millilitres sur la glace. Pour la purification des microvessels, granulez les tissus du SNC homogénéise par centrifugation et jetez les supernatants. Pour un petit spécimen vertébré isolé par microvessel, pipette le cortex, le cervelet, le tronc cérébral, le lobe optique et les granulés de moelle épinière, en cinq millilitres de solution MV-2 fraîche et glacée par échantillon, environ 10 fois, avant d’ajouter cinq millilitres de solution MV-2 glacée à chaque tube.Retourner soigneusement les tubes pour mélanger, et re-suspendre l’hypothalamus et les granulés pituitaires dans un millilitre de solution MV-2. Pour l’isolement des microvérules de gros spécimens vertébrés, ajouter 20 millilitres de solution MV-2 glacée au cortex, au cervelet, au tronc cérébral et aux granulés de microvéssel de la moelle épinière, et suspendre à nouveau les granulés dans un revolver à tube à 40 rotations par minute pendant environ 5 minutes. À la fin de la suspension, séparez les lycates de tissu cns par centrifugation, et faites pivoter lentement chaque tube pour permettre au surnatant de passer le long du mur pour détacher soigneusement la couche épaisse et dense de myéline sur l’interface liquide des parois du tube.Jetez les interfaces myéline et liquide, et épongez la paroi intérieure de chaque tube à l’aide d’une spatule enveloppée d’un lingette en papier à faible peluche. Ensuite, utilisez un lingette en papier à faible peluche tordue pour absorber l’excès de liquide, et utilisez des pointes à faible liaison pour suspendre à nouveau chaque granulé dans un millilitre de solution MV-3. Pour l’élitution et la filtration des microvéraux, mélanger quelques millilitres de solution MV-3 fraîche à chaque boue de microvessel tissu CNS, et tout en mélangeant pour éviter les agrégats, filtrer chaque suspension à travers une passoire Pruitt en tubes coniques individuels de 50 millilitres.Placez un filtre net en nylon de 20 micromètres sur un support de filtre modifié par région CNS. Transférez le porte-filtre sur un tube conique de 50 millilitres et mouillez le filtre avec cinq millilitres de solution MV-3 glacée, en vous assurant que le tampon verse le porte-filtre dans le tube conique. Transférez les microvéssels épuutés sur chaque filtre net en nylon de 20 micromètres et rincez les microvéssels avec cinq à 10 millilitres de solution MV-3 glacée.Utilisez des forceps pour transférer chaque filtre dans des beakers individuels contenant la solution MV-3 glacée, et secouez doucement chaque filtre pendant environ 30 secondes pour détacher les microvéssels. Après le transfert à un tube conique de 15 millilitres, recueillir les microvérules par centrifugation, et utiliser une pipette à faible liaison pour suspendre à nouveau chaque granulé dans un millilitre de glace MV-3 solution. Ensuite, transférez les suspensions de microvérules de petits spécimens vertébrés dans un tube de microcentrifugeuse de 1,7 millilitre pour centrifugation pendant cinq minutes à 20 000 fois G, en quatre degrés Celsius.Pour les gros spécimens de vertébrés, transférer la suspension dans des tubes de centrifugeuse individuels de cinq millilitres, et ajouter quatre millilitres de solution MV-3 pour centrifugation pendant cinq minutes à 2000 fois G en quatre degrés Celsius. Les composants intrinsèques de l’unité neurovasculaire peuvent être détectés dans les microvétalliques, isolés comme démontré, par immunolabeling pour CD31, PDGFR-bêta, et aquaporin quatre, y compris les microvétalliques corticales, cerebellar, pituitaires, hypothalamiques, tige de cerveau, et microvétules spinales. De même, l’expression de la protéine VE-cadherin de jonction des adhérents, des protéines de jonction serréeS CLDN5 et Zonula Occludens-1, de l’anguline-1 tricellulaire de protéine de jonction, et des marques basales chemokine ligand CXCL motif 12, et gamma-glutamyltransferase-1, peut être visualisée.En outre, la majorité des microvételles sont dépourvues de l’expression de l’actine musculaire alpha lisse, ce qui indique que ce protocole d’isolement cible sélectivement les microvssels de petit calibre. Les microvérètes obtenues auprès d’autres petits vertébrés lissencéphales, comme les oiseaux, les menteurs, les grenouilles et les poissons, partagent certaines caractéristiques morphologiques, ce qui suggère que cette méthode est utile pour caractériser davantage les différences dans les unités neurovasculaires entre les espèces. La quantification des changements dans l’expression de protéine indique une augmentation de la molécule d’adhérence vasculaire de cellules un, et de la molécule jonctionnelle d’adhérence B le long des microvessels de moelle épinière, pendant le pic de l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale.Cependant, la molécule vasculaire d’adhérence de cellules on est également sensiblement augmentée dans les microvessels pituitaires, et diminuée dans les microvessels d’hypothalamus et de tronc cérébral. En outre, des changements sont observés dans la molécule d’adhérence vasculaire de cellules une expression pendant l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale chronique dans tous les tissus de CNS, et dans l’expression jonctionnelle de molécule d’adhérence B dans l’hypothalamus et les microvessels pituitaires. Des analyses quantitatives, telles que la tache occidentale, le PCR et l’immunohistochimie, peuvent être exécutées suivant cette procédure pour révéler des aperçus des modèles d’expression de gène et de protéine dans la barrière de sang-cerveau.Le paraformaldéhyde est un réaccène extrêmement toxique, et doit toujours être manipulé sous le capot de fumée tout en portant le PPE approprié.

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Cette vidéo démontre l'isolement des vaisseaux intacts du cerveau d'une souris qui constituent la barrière hémato-encéphalique (BHE) avec les neurones et les cellules gliales. Les vaisseaux isolés peuvent être utilisés comme modèle in vitro pour étudier leur rôle dans le maintien de l’homéostasie cérébrale.

Isolement des vaisseaux cérébraux de souris : un protocole pour isoler les vaisseaux intacts d’un échantillon de cerveau murin

Cette vidéo montre le processus d’isolement des microvaisseaux cérébraux des rats euthanasiés. Il comprend la dissection du cerveau, le nettoyage des tissus et la digestion mécanique, suivie d’une centrifugation répétée pour isoler la fraction pure des microvaisseaux.

Procédé d’isolement d’unités neurovasculaires à partir du cerveau de rat

Les cellules endothéliales microvasculaires cérébrales (BMEC) sont interconnectées par des protéines jonctionnelles spécifiques formant une barrière hautement régulée séparant le sang et le système nerveux central (SNC), ce que l’on appelle la barrière hémato-encéphalique (BHE). L’isolement des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales primaires murines, comme nous l’avons vu dans ce protocole, permet des études in vitro détaillées de la BHE.

Isolement de cellules primaires murins cerveau endothéliales microvasculaires

Ce protocole décrit un préconditionnement hypoxique répétitif, ou de brèves expositions à une hypoxie systémique qui réduisent les volumes d’infarctus et la perturbation de la barrière hémato-encéphalique suite à une occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne chez la souris. Il détaille également la double quantification du volume de l’infarctus et de la perturbation de la barrière hémato-encéphalique après un AVC afin d’évaluer l’efficacité de la protection neurovasculaire.

Quantification de la protection neurovasculaire Après répétitive hypoxique préconditionnement et transitoire Moyen Cerebral Artery Occlusion chez la souris

Nous décrivons un protocole permettant la purification du compartiment vasculaire du cerveau de la souris. Les vaisseaux cérébraux isolés comprennent des cellules endothéliales reliées par des jonctions serrées et entourées d’une lame basale continue, des péricytes, des cellules musculaires lisses vasculaires, ainsi que des membranes astrogliales périvasculaires.

Purification de souris vaisseaux cérébraux

Ce manuscrit décrit un protocole simple et reproductible pour l’isolement des artérioles intracérébrales (un groupe de vaisseaux sanguins englobant les artérioles parenchymateuses, les artérioles pénétrantes et les artérioles précapillaires) chez la souris, à utiliser dans la myographie de pression, l’immunofluorescence, la biochimie et les études moléculaires.

Isolement et Cannulation de parenchyme cérébral artérioles

Capillaires cérébraux isolés du tissu de cerveau humain peuvent servir comme un modèle préclinique pour étudier la fonction de barrière dans des conditions physiologiques et physiopathologiques. Nous présentons ici un protocole optimisé pour isoler les capillaires du cerveau du tissu de cerveau humain frais.

Isolement des capillaires cérébraux du tissu de cerveau humain frais

Ici, on décrit une méthode pour l’isolement des microvaisseaux de cerveau de rat et pour la préparation des échantillons de la membrane. Ce protocole a l’avantage clair de produire des microvaisseaux enrichi échantillons avec la protéine acceptable donnent sur des animaux. Échantillons peuvent être ensuite utilisés pour les analyses de protéines robuste à l’endothélium microvasculaire cérébral.

Une méthode Simple et reproductible pour préparer les échantillons de la Membrane des microvaisseaux de cerveau de Rat fraîchement isolées

Cet article présente deux protocoles optimisés pour l’examen des cellules immunitaires résidentes et dérivées périphériques du système nerveux central, y compris le cerveau, la moelle épinière et les méninges. Chacun de ces protocoles permet de déterminer la fonction et la composition des cellules occupant ces compartiments dans des conditions d’équilibre et inflammatoires.

Isolement des tissus du système nerveux central et des méninges associées pour l’analyse en aval des cellules immunitaires

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement in vitro de plusieurs populations de cellules gliales à partir d’un SNC de souris. Cette méthode permet la ségrégation de la microglie régionale, des cellules précurseurs d’oligodendrocytes et des astrocytes pour étudier les phénotypes de chacun dans une variété de systèmes de culture.

Dissection et isolement de la glie murine de plusieurs régions du système nerveux central

À ce jour, les protocoles d’isolement simultané de tous les principaux types de cellules résidentes du système nerveux central à partir d’une même souris sont une demande non satisfaite. Le protocole montre une procédure applicable chez les souris naïves et expérimentales atteintes d’encéphalomyélite auto-immune pour étudier les réseaux cellulaires complexes au cours de la neuroinflammation et réduire simultanément le nombre de souris requis.

Isolement simultané de types de cellules résidentes du système nerveux central chez des souris adultes atteintes d’encéphalomyélite auto-immune

Découvrez une méthode fiable d'isolement des micronavires du système nerveux central chez cinq groupes de vertébrés. Cette technique rapide, sans ultracentrifugation, permet des études comparatives de la microvasculature cérébrale.

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