Isolement fiable des micronavires du système nerveux central dans cinq groupes de vertébrés

Ce protocole est significatif parce qu’il permet la comparaison de la microvasculature entre différentes régions du système nerveux central, ainsi qu’entre différents individus. Cette technique d’isolation des microvétiles peut être complétée en une seule journée, et elle élimine le besoin d’ultracentrifugation et de dissociation enzymatique. Enlever les méninges et le plexus choroïde peut être difficile.

Assurez-vous de travailler lentement et soigneusement pour assurer l’ablation complète de chaque tissu. Pour la dissection tissulaire du SNC à partir d’un petit spécimen de vertébrés lissencéphales, placez le cerveau récolté dans un tube conique de 15 millilitres contenant la solution MV-1 sur la glace, et utilisez des forceps pour récupérer l’hypophyse de la sella turcica du crâne. Placez l’hypophyse dans un tube de microcentrifugeuse de 1,7 millilitre de solution MV-1 sur la glace, et retirez la peau et le muscle pour exposer la colonne vertébrale.

Après avoir enlevé les membres, la cage thoracique et les organes internes, utilisez une seringue de 10 millilitres munie d’une aiguille de calibre 18 pour rincer la colonne vertébrale avec une solution MV-1 fraîche, dans une direction caudale à rostrale dans tout le contre-courant vertébral lombaire. Placez ensuite la moelle épinière dans un tube de 5 millilitres contenant une solution MV-1 fraîche. Ensuite, placez le cerveau dans une boîte de Pétri sous le microscope disséquant, et retirez les méninges avec la piqûre à double proue.

Assurez-vous de vérifier la moelle épinière pour vous assurer qu’il ne reste plus de méninges. Utilisez les forceps pour séparer l’hypothalamus, le cervelet, le tronc cérébral et le cortex. Si nécessaire, utilisez des forceps et des ciseaux d’iris et de ressort pour exciser les bulbes olfactifs et le thalamus, et utilisez la piqûre à double proue pour enlever tout le plexus choroïde de tous les ventricules du cerveau.

Pour la dissection tissulaire du SNC à partir d’un grand spécimen de vertébrés gyrencéphales, utilisez un microscope disséqué et une piqûre à double proue, des forceps et des ciseaux d’iris et de ressort pour enlever les méninges de chaque tissu du SNC, en prenant soin d’enlever tout plexus choroïde des ventricules cérébraux. Pour l’homogénéisation des tissus du SNC récoltés, hacher chaque région du SNC en morceaux d’un à deux millimètres dans des boîtes de Pétri individuelles. Pour homogénéiser les tissus du SNC à partir de petits spécimens de vertébrés, utilisez une pipette de transfert pour ajouter un millilitre de solution MV-1 pour suspendre le tissu haché.

Utilisez ensuite la même pipette de transfert pour distribuer le cortex, le cervelet, le tronc cérébral, le lobe optique et les morceaux de moelle épinière en broyeurs individuels de tissu de verre de 10 millilitres, et utilisez un pilon PTFE et cinq millilitres de solution MV-1 pour moudre chaque ensemble de tissus pendant environ 10 coups. Transférez chaque boue tissulaire dans des tubes coniques individuels de 15 millilitres sur la glace, et utilisez des forceps pour placer l’hypothalamus et l’hypophyse dans 100 microlitres de solution MV-1, dans des tubes individuels de 1,7 millilitre. Ensuite, homogénéisez soigneusement chaque tissu à l’aide d’un micropestre en verre.

Pour homogénéiser un grand spécimen de vertébrés, utilisez une pipette de transfert coupée biseauté pour transférer le tissu haché dans un broyeur de tissu en verre de 55 millilitres et fixez le broyeur à un agitateur aérien. Ajouter la moitié du volume recommandé de solution MV-1 en fonction de l’homogénéisation de la partie spécifique du SNC indiquée dans le tableau et activer l’agitateur supérieur à environ 150 rotations par minute. Déplacez soigneusement le tube de verre de haut en bas pendant environ 30 secondes avant d’éteindre l’agitateur supérieur pour ajouter plus de solution MV-1 pour une homogénéisation supplémentaire, jusqu’à ce qu’une boue homogène soit obtenue.

Transférer ensuite le tissu homogénéisé dans un tube conique de 50 millilitres sur la glace. Pour la purification des microvessels, granulez les tissus du SNC homogénéise par centrifugation et jetez les supernatants. Pour un petit spécimen vertébré isolé par microvessel, pipette le cortex, le cervelet, le tronc cérébral, le lobe optique et les granulés de moelle épinière, en cinq millilitres de solution MV-2 fraîche et glacée par échantillon, environ 10 fois, avant d’ajouter cinq millilitres de solution MV-2 glacée à chaque tube.

Retourner soigneusement les tubes pour mélanger, et re-suspendre l’hypothalamus et les granulés pituitaires dans un millilitre de solution MV-2. Pour l’isolement des microvérules de gros spécimens vertébrés, ajouter 20 millilitres de solution MV-2 glacée au cortex, au cervelet, au tronc cérébral et aux granulés de microvéssel de la moelle épinière, et suspendre à nouveau les granulés dans un revolver à tube à 40 rotations par minute pendant environ 5 minutes. À la fin de la suspension, séparez les lycates de tissu cns par centrifugation, et faites pivoter lentement chaque tube pour permettre au surnatant de passer le long du mur pour détacher soigneusement la couche épaisse et dense de myéline sur l’interface liquide des parois du tube.

Jetez les interfaces myéline et liquide, et épongez la paroi intérieure de chaque tube à l’aide d’une spatule enveloppée d’un lingette en papier à faible peluche. Ensuite, utilisez un lingette en papier à faible peluche tordue pour absorber l’excès de liquide, et utilisez des pointes à faible liaison pour suspendre à nouveau chaque granulé dans un millilitre de solution MV-3. Pour l’élitution et la filtration des microvéraux, mélanger quelques millilitres de solution MV-3 fraîche à chaque boue de microvessel tissu CNS, et tout en mélangeant pour éviter les agrégats, filtrer chaque suspension à travers une passoire Pruitt en tubes coniques individuels de 50 millilitres.

Placez un filtre net en nylon de 20 micromètres sur un support de filtre modifié par région CNS. Transférez le porte-filtre sur un tube conique de 50 millilitres et mouillez le filtre avec cinq millilitres de solution MV-3 glacée, en vous assurant que le tampon verse le porte-filtre dans le tube conique. Transférez les microvéssels épuutés sur chaque filtre net en nylon de 20 micromètres et rincez les microvéssels avec cinq à 10 millilitres de solution MV-3 glacée.

Utilisez des forceps pour transférer chaque filtre dans des beakers individuels contenant la solution MV-3 glacée, et secouez doucement chaque filtre pendant environ 30 secondes pour détacher les microvéssels. Après le transfert à un tube conique de 15 millilitres, recueillir les microvérules par centrifugation, et utiliser une pipette à faible liaison pour suspendre à nouveau chaque granulé dans un millilitre de glace MV-3 solution. Ensuite, transférez les suspensions de microvérules de petits spécimens vertébrés dans un tube de microcentrifugeuse de 1,7 millilitre pour centrifugation pendant cinq minutes à 20 000 fois G, en quatre degrés Celsius.

Pour les gros spécimens de vertébrés, transférer la suspension dans des tubes de centrifugeuse individuels de cinq millilitres, et ajouter quatre millilitres de solution MV-3 pour centrifugation pendant cinq minutes à 2000 fois G en quatre degrés Celsius. Les composants intrinsèques de l’unité neurovasculaire peuvent être détectés dans les microvétalliques, isolés comme démontré, par immunolabeling pour CD31, PDGFR-bêta, et aquaporin quatre, y compris les microvétalliques corticales, cerebellar, pituitaires, hypothalamiques, tige de cerveau, et microvétules spinales. De même, l’expression de la protéine VE-cadherin de jonction des adhérents, des protéines de jonction serréeS CLDN5 et Zonula Occludens-1, de l’anguline-1 tricellulaire de protéine de jonction, et des marques basales chemokine ligand CXCL motif 12, et gamma-glutamyltransferase-1, peut être visualisée.

En outre, la majorité des microvételles sont dépourvues de l’expression de l’actine musculaire alpha lisse, ce qui indique que ce protocole d’isolement cible sélectivement les microvssels de petit calibre. Les microvérètes obtenues auprès d’autres petits vertébrés lissencéphales, comme les oiseaux, les menteurs, les grenouilles et les poissons, partagent certaines caractéristiques morphologiques, ce qui suggère que cette méthode est utile pour caractériser davantage les différences dans les unités neurovasculaires entre les espèces. La quantification des changements dans l’expression de protéine indique une augmentation de la molécule d’adhérence vasculaire de cellules un, et de la molécule jonctionnelle d’adhérence B le long des microvessels de moelle épinière, pendant le pic de l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale.

Cependant, la molécule vasculaire d’adhérence de cellules on est également sensiblement augmentée dans les microvessels pituitaires, et diminuée dans les microvessels d’hypothalamus et de tronc cérébral. En outre, des changements sont observés dans la molécule d’adhérence vasculaire de cellules une expression pendant l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale chronique dans tous les tissus de CNS, et dans l’expression jonctionnelle de molécule d’adhérence B dans l’hypothalamus et les microvessels pituitaires. Des analyses quantitatives, telles que la tache occidentale, le PCR et l’immunohistochimie, peuvent être exécutées suivant cette procédure pour révéler des aperçus des modèles d’expression de gène et de protéine dans la barrière de sang-cerveau.

Le paraformaldéhyde est un réaccène extrêmement toxique, et doit toujours être manipulé sous le capot de fumée tout en portant le PPE approprié.