Une méthode Simple et reproductible pour préparer les échantillons de la Membrane des microvaisseaux de cerveau de Rat fraîchement isolées

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les microvaisseaux cérébraux du cerveau du rat pour des études biochimiques visant à comprendre les caractéristiques moléculaires de la barrière hémato-encéphalique des mammifères. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en physiologie de la barrière hémato-encéphalique et en neuropharmacologie, telles que la régulation, la localisation et l’expression des protéines de jonction serrée et des transporteurs endogènes dans la santé et la maladie. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons isoler un nombre suffisant de microvaisseaux de haute qualité à partir d’un animal individuel tout en tenant compte de la variabilité naturelle de l’expression des protéines entre les animaux individuels.

Bianca Reilly, une étudiante de premier cycle exceptionnelle de mon laboratoire, fera la démonstration de cette technique. Après avoir euthanasié et décapité un rat Sprague-Dawley selon le protocole textuel, utilisez des ciseaux chirurgicaux pour réséquer la peau du crâne du rat en faisant une seule coupe transversale. À l’aide de rongeurs, retirez soigneusement la plaque crânienne et exposez le cerveau.

Ensuite, à l’aide d’une spatule, retirez l’organe. Détachez le cerveau et placez le tissu cérébral isolé dans un tube conique de 50 millilitres avec cinq millilitres de BMB et 5,0 microlitres de cocktail d’inhibiteurs de protéase. Pour traiter le tissu, transférez-le dans une boîte de Pétri propre.

Ensuite, à l’aide d’une pince, roulez doucement le cerveau sur un papier filtre de 12,5 centimètres de diamètre pour retirer les méninges externes, qui adhèrent lâchement au cortex cérébral. Au cours de cette étape, il faut s’assurer que tout le tissu méningé a été retiré de l’échantillon de tissu cérébral. Les méninges peuvent être visualisées comme un tissu membraneux clair qui peut être facilement retiré du tissu cérébral.

Appuyez doucement le tissu cérébral contre le papier filtre et roulez à nouveau le tissu en tournant fréquemment le papier filtre pendant cette étape. Ensuite, à l’aide d’une pince, séparez le plexus choroïde des hémisphères cérébraux. Ensuite, aplatissez à nouveau doucement le tissu cérébral et utilisez des pinces pour retirer les bulbes olfactifs adjacents à la substance blanche.

Placez le tissu cérébral cortical dans un mortier de verre réfrigéré. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de BMB avec un cocktail inhibiteur de protéase. À l’aide d’un homogénéisateur aérien, insérez un pilon dans le mortier et homogénéisez le tissu cérébral à l’aide de 15 mouvements de haut en bas à 3 700 tr/min.

Ensuite, versez l’homogénat dans des tubes à centrifuger étiquetés. Entre les échantillons, utilisez de l’éthanol à 70 % pour nettoyer le pilon. Pour effectuer la centrifugation, ajoutez 8,0 millilitres de solution de dextran à 26 % dans chaque tube à centrifuger étiqueté contenant de l’homogénat de cerveau.

Retournez le tube deux fois, puis vortex complètement l’échantillon. Effectuez le vortex de chaque échantillon en utilisant plusieurs angles pour assurer un mélange complet de la solution d’homogénat de cerveau avec une solution de dextran à 26 %. Centrifuger les échantillons à 5 000 g et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes.

Aspirez le surnageant et mettez à nouveau la pastille en suspension dans 5,0 millilitres de BMB avec un cocktail inhibiteur de protéase. Ensuite, vortex la pastille pour assurer un mélange complet. Ensuite, ajoutez 8,0 millilitres de dextran à 26 % dans chaque tube de centrifugation et vortex comme nous venons de le démontrer.

Ensuite, centrifugez à nouveau les échantillons. À l’aide d’une fiole à vide et d’une pipette en verre, aspirez le surnageant et assurez-vous que la pastille contenant le microvaisseau cérébral n’est pas perturbée. Remettre la pastille en suspension dans du BMB avec un inhibiteur de protéase, puis 26 % de dextran deux fois de plus.

Après la centrifugation finale, ajoutez 5,0 millilitres de BMB à chaque pastille et vortex pour remettre l’échantillon en suspension. En utilisant le protocole démontré dans cette vidéo, l’isolement réussi de microvaisseaux intacts du cerveau du rat a été effectué. Sur cette image, le microvaisseau est coloré à l’aide d’un anticorps contre Oatp1a4, un transporteur bien exprimé au niveau de la membrane plasmique des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales.

Comme l’a démontré le Western blot, des préparations membranaires à partir de microvaisseaux prélevés sur des rats Sprague-Dawley femelles ont été enrichies en PECAM-1, également connu sous le nom de CD31, une protéine marqueur de la microvascularisation cérébrale. Lors de l’optimisation de ce protocole, l’enrichissement en PECAM a été observé dans des échantillons de membranes préparés à l’aide de deux et quatre étapes de centrifugation au dextran. Comme déterminé par le test de protéines de Bradford et répertorié dans ce tableau, les préparations membranaires produisent généralement des concentrations de protéines variant entre 5,0 milligrammes par millilitre et 10,0 milligrammes par millilitre.

Les valeurs protéiques ont été déterminées à l’aide d’une courbe standard générée à l’aide de la BSA comme norme. Ici, on voit un western blot pour la protéine de transport de la BHE Glut1. Des bandes simples claires de 54 kilodaltons ont été détectées pour cette protéine BHE fortement exprimée dans chaque échantillon membranaire.

Ce graphique illustre une expression plus élevée de Glut1 au niveau de la BHE chez les rats mâles par rapport aux rats femelles. Aucune différence dans l’expression de l’ATPase sodium/potassium n’a été observée entre les animaux mâles et femelles. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à 2 heures et demie si elle est exécutée correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de garder tous les échantillons sur de la glace tout au long du protocole et de faire attention lors de l’aspiration du surnageant de la pastille du microvaisseau après les étapes de centrifugation. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, comme l’analyse par co-immunoprécipitation, peuvent être effectuées sur des échantillons de microvaisseaux pour répondre à des questions supplémentaires, comme l’association de différentes protéines au sein d’un même complexe protéique au niveau de la barrière hémato-encéphalique. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la physiologie de la barrière hémato-encéphalique et de la neuropharmacologie pour explorer les caractéristiques moléculaires de la barrière hémato-encéphalique dans la santé et dans des modèles de maladies neurologiques chez les rongeurs.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler des microvaisseaux de haute qualité du cerveau du rat pour vos propres études de la biologie de la barrière hémato-encéphalique dans la santé et la maladie.