Transformation génique basée sur un vecteur chromosomique artificiel bactérien binaire chez les plantes Arabidopsis : une technique pour générer des plantes transgéniques avec insertion en une seule copie

Commencez par les plantes Arabidopsis portant des capitules immatures. Trempez les capitules dans une suspension cellulaire d’Agrobacterium portant de l’ADN-T cloné avec un chromosome artificiel bactérien binaire ou BIBAC, un vecteur se répliquant à la fois dans les systèmes E. coli et Agrobacterium. Ce vecteur binaire de l’ADN-T peut délivrer de grands transgènes tels que le gène de résistance aux herbicides et des marqueurs sélectionnables par fluorescence le long d’un promoteur spécifique à la graine.

Pendant que les capitules sont encore immergés, agitez doucement les plantes pour améliorer leur contact avec Agrobacterium. Grâce à sa capacité inhérente à infecter les plantes, Agrobacterium transfère le transgène dans la cellule florale. Lorsque le transgène pénètre dans la cellule, il se déplace vers le noyau et fusionne avec le génome de la plante.

Maintenant, enveloppez la plante dans un film alimentaire et incubez dans l’obscurité pour retenir l’humidité et une meilleure transformation. Retirez le film et faites pousser les plantes dans des conditions physiologiques jusqu’à ce qu’elles produisent des graines.

Ensuite, récoltez les graines et observez-les au microscope à fluorescence pour sélectionner les transformants. Maintenant, cultivez les graines transformées dans des conditions appropriées jusqu’à la germination. Vaporisez les plantes avec un herbicide et incuberez.

Les plantes avec insertion de plusieurs transgènes subissent un silençage génique et se fanent, tandis que les plantes avec une insertion en une seule copie expriment une enzyme active métabolisant l’herbicide et survivent au traitement. Extrayez l’ADN génomique des transformants survivants et effectuez une PCR pour calculer l’efficacité de l’insertion en une seule copie.

Pour préparer les plantes d’Arabidopsis à la transformation, cultivez les plantes d’Arabidopsis dans une serre ou une chambre de culture à climat contrôlé, jusqu’à ce qu’elles fleurissent. Clipsez les premiers boulons pour permettre à d’autres boulons secondaires de sortir. Les plantes sont prêtes à tremper quatre à six jours après la coupe, lorsque les plantes ont de nombreux capitules immatures et peu de siliques fertilisés.

Pour effectuer un trempage floral, trempez les inflorescences pendant 5 à 10 secondes dans la suspension d’Agrobacterium. Utilisez une agitation douce. Enveloppez les parties aériennes des plantes dans du film alimentaire pour maintenir l’humidité élevée et couvrez les pots de fleurs avec une boîte pour garder les plantes dans l’obscurité.

Incuber les plantes pendant deux jours dans une serre ou une chambre de croissance. Après deux jours, retirez la boîte et le film alimentaire et faites pousser les plantes jusqu’à maturité dans une serre ou une chambre de croissance. Pour augmenter l’efficacité de la transformation, les mêmes plantes peuvent être re-trempées sept jours après le premier trempage.

Ensuite, lorsque les plantes transformées sont matures et sèches, récoltez les graines. Mettez en commun et analysez les graines de plantes transformées avec la même construction en un seul ensemble. Dans le cas où les plantes sont transformées avec un dérivé plasmidique de BIBAC-RFP-Gateway, identifiez les plantes transgéniques en analysant les graines à l’aide de la microscopie à fluorescence.

Pour détecter l’expression de DsRed dans les témentages, imagez les graines à une excitation de 560 nanomètres et une émission de 600 à 650 nanomètres. Séparez les graines fluorescentes de leurs homologues non fluorescentes à l’aide d’une pince.

Pour dépister les plantes transgéniques transformées avec un dérivé plasmidique de BIBAC-BAR-Gateway, semez les graines dans des plateaux remplis de terre. Assurez-vous d’un étalement uniforme des graines sur les plateaux, en suspendant les graines dans de la gélose à 0,1 % dans un milieu MS 0,5X, et étalez les graines à l’aide d’une pipette de 1 millilitre.

Stimulez la germination des graines de manière synchrone en les incubant pendant au moins deux jours à 4 degrés Celsius. Cela peut être fait avant ou après le semis des graines. Deux et trois semaines après le semis des graines, vaporisez les semis avec une solution de glufosinate-ammonium à 0,5 %. Utilisez 500 millilitres de solution de glufosinate-ammonium par mètre carré. Transférez les semis survivants dans des pots. Analyser les plantes résistantes au glufosinate-ammonium, par PCR pour la présence de la construction d’intérêt.