Name: Protéine fluorescente verte bibloc pour visualiser les effecteurs livré de bactéries lors de l’Infection (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Découvrez la visualisation des effecteurs bactériens dans les cellules végétales grâce au système GFP superfolder bibloc optimisé. Cette méthode utilise Nicotiana benthamiana et Arabidopsis thaliana pour étudier les interactions plante-microbe.

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Cette recherche a été financée par la base Science Research Program grâce à la Fondation de la recherche nationale de Corée (NRF) financé par le ministère de la Science, les TIC et la planification future (FRO-2018R1A2A1A05019892) DC et par une subvention du centre de reproduction végétale moléculaire ( PMBC) du programme de prochaine génération Biogreen 21 de l’Administration du développement Rural (PJ013201) d’ép. Nous remercions le centre d’imagerie du Centre National de Instrumentation de gestion de l’environnement fournir un microscope confocal pour le tournage.

Remarque : Toutes les mesures sont effectuées à température ambiante, sauf indication contraire.
1. préparation du matériel végétal (4 semaines)
<ol><li>Préparation pour les N. benthamiana plants<ol>
<li>Semer les 2 graines de N. benthamiana sur la surface du sol de chaque pot, recouvrir le plateau d’un dôme en plastique et laisser les graines à germer dans un 25 ° C, chambre de croissance humidité de 60 % avec un cycle de photopériode de lumière/obscurité de 8 h/16.</li>
		<li>Après deux semaines, choisir et jeter la plantule plus petite dans chaque pot et continuer à faire pousser des plantes dans les mêmes conditions de croissance tel qu’appliqué pour la germination à l’étape 1.1.1. Ajouter 1 L d’eau par bac tous les deux jours. Remarque : Les conditions de croissance des plantes peuvent varier entre laboratoires. Par conséquent, se conformer au protocole d’arrosage régulier pour pousser la plante dans un état sain.</li>
		<li>En une semaine, transférer les plantes à un nouveau plateau et organisez-les avec un espace suffisant pour la poursuite de la croissance. Poursuivre sa croissance les plantes dans les conditions décrites à l’étape 1.1.1 jusqu'à ce qu’ils sont prêts à s’infiltrer à l’âge de 4 semaines. Remarque : La croissance des plantes peut varier selon la condition de la croissance dans l’ensemble de laboratoires. Généralement, nous constatons que les 4 semaines N. benthamiana plantes portent environ six feuilles.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation pour les plantes transgéniques a. thaliana<ol>
<li>Se référer à la Table des matières et commander les semences transgéniques d’Arabidopsis .</li>
		<li>Faire tremper les graines d’Arabidopsis transgéniques ~ 50-100 dans 1 mL d’eau distillée et les stocker à 4 ° C pendant 3 jours dans l’obscurité pour synchroniser le début de la germination.</li>
		<li>Semer les graines d’environ 2-3 sur la surface du sol d’un germoir de plante et recouvrir le plateau d’un dôme en plastique. Laissez les graines germent à 23 ° C, humidité de 60 % avec un cycle de photopériode de lumière/obscurité de 10/14 h. Remarque : Les graines doivent être homozygotes. Cependant, nous recommandons confirmant la présence du transgène dans le lot. Dans ce cas, stériliser les graines en lavant avec de l’éthanol à 70 % pendant 2 min, 50 % eau de Javel (hypochlorite de 2 % environ) contenant 0,05 % de triton X-100 pendant 5 min. Suivez en lavant 5 - 6 fois avec de l’eau bidistillée stérile (ddH2O). Après stérilisation, stratifier à 4 ° C pendant 3 jours et leur plaque sur un milieu de germination de plante contenant 25 µg/L de l’hygromycine B pour sélectionner les plantes transgéniques.</li>
		<li>Après une semaine, ne laisser qu’un seul plant par Motte et poursuivre la culture de plantes dans les mêmes conditions de croissance utilisées pour l’étape 1.2.3. Remarque : Quatre semaines plantes ont été utilisées pour l’infection de P. syringae . Arrose les plantes tous les jours pour garder des plantes en bonne santé.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. préparation de la Culture de Pseudomonas (~ 1 semaine)
<ol><li>Construction du plasmide pour transformation de Pseudomonas<ol>
<li>Se référer à la Table des matières et commander le vecteur (s) désirée de l’effecteur T3SS-basé système vecteur25.</li>
		<li>Insérer le gène de l’effecteur d’intérêt dans le vecteur de livraison effecteur à l’aide de recombinaison site-spécifique clonage25. Remarque : Lors du contrôle de la localisation sous-cellulaire des protéines effectrices pleine longueur, mettre le gène pleine longueur en pBK-GW-1-2 ou pBG-GW-1-2. Il est également possible de choisir pBK-GW-1-4 ou pBG-GW-1-4 contenant 2 x sfGFP11 pour augmenter le signal de fluorescence. Dans le cas d’un effecteur partiel dépourvu peptide signal, utilisez pBK-GW-2-2 ou pBK-GW-2-4. Reportez-vous au parc et coll. pour des informations détaillées sur les vecteurs de livraison effecteur25.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transformer le plasmide portant un effecteur fusionné à la balise sfGFP11 de P. syringae pv. Tomate (Pst) CUCPB5500 à l’aide d’électroporation standard29. Remarque : Les autres souches de Pseudomonas peuvent être utilisés si nécessaire. Le système de tag sfGFP11, est conçu pour un large éventail de vecteurs30 et l’expression du gène de l’effecteur est réglementée par le promoteur de la AvrRpm1, qui est comparable avec, par exemple, Pseudomonas fluorescens (EthAn)31.</li>
	<li>Étaler les cellules bactériennes transformées doucement sur la surface des plaques de gélose du roi B contenant 100 rifampicine µg/mL et 25 kanamycine µg/mL ou 25 µg/mL de gentamycine. Incuber à 28 ° C pendant 2 jours.</li>
	<li>Ensemencer une colonie dans un milieu liquide du roi B avec des antibiotiques appropriés pour le vecteur utilisé et poussent les cellules pendant la nuit à 28 ° C sous agitation à 200 tr/min.</li>
	<li>Faire un stock de glycérol. Ajouter glycérol stérilisés à l’autoclave à une concentration finale de 50 % et les conserver à-80 ° C.</li>
</ol>3. transitoire Expression sfGFP1-10 Organelle cibléesOPT dans N. benthamiana (4 jours)
<ol><li>Préparation de la culture Agrobacterium<ol>
<li>Commander le vecteur (s) désiré d’organelle ciblées sfGFP1-10OPT plasmid(s) (reportez-vous à la Table des matières).</li>
		<li>Transformer la plasmid(s) en Agrobacterium tumefaciens souche de cellules GV310132. Cultiver les cellules sur gélose Luria-Bertani (LB) additionné de 50 µg/mL kanamycine et 50 rifampicine µg/mL à 28 ° C durant 2 jours.</li>
		<li>D’une seule colonie sur la gélose LB, ensemencer les cellules dans 5 mL de milieu LB liquide additionné de 50 µg/mL kanamycine et 50 rifampicine µg/mL. Cultiver les cellules pendant la nuit à 28 ° C sous agitation à 200 tr/min.</li>
		<li>Récolte les cellules par centrifugation à 3 000 x g pendant 10 min. égoutter les médias surnageants et Resuspendre le culot dans 1 mL de fraîchement faite tampon d’infiltration.</li>
		<li>Mesurer la quantité d’Agrobacterium en obtenant la valeur de densité optique (do) à une absorbance de 600 nm (Abs 600 nm). Ajuster l' OD600 des bactéries à 0,5 avec le tampon de l’infiltration. Note : 1 mL de suspension est assez pour s’infiltrer sur deux points.</li>
		<li>Laissez la culture à la température ambiante sur un doux rocker 1-5 h avant l’infiltration.</li>
		<li>Introduisez un trou dans le Centre des feuilles pour s’infiltrer à bout 10 µL. Utiliser une seringue sans aiguille de 1 mL pour infiltrer les suspensions d’Agrobacterium . Soigneusement et lentement injecter environ 500 µL de la suspension préparée à partir d’étape 3.1.5 dans le côté adaxial feuille par l’intermédiaire de la seringue. Répétez l’infiltration au moins trois plantes pour répliques expérimentales. Remarque : Pour des raisons de santé et de sécurité, protection des yeux doit être portée au cours de l’infiltration.</li>
		<li>Essuyez la suspension bactérienne reste sur les feuilles et marquent la limite de la région infiltrée.</li>
		<li>Garder les plantes infiltrés dans les mêmes conditions de croissance utilisées pour l’étape 1.1.1 durant 2 jours.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. inoculation de Pseudomonas (4 jours)
<ol><li>Ensemencer la souche Pseudomonas transformée sur le stock de glycérol en étape 2.5 du roi B agar Media avec les antibiotiques appropriés à 28 ° C durant 2 jours. Remarque : La santé des Pseudomonas est très critique. Si les colonies ne font pas bien, ensemencer les cellules à nouveau ou propager les cellules dans un milieu liquide du roi avant de procéder.</li>
	<li>Ensemencer une anse de cellules de Pseudomonas dans les milieux liquides Mannitol-Glutamate (MG) à 28 ° C sous agitation à 200 tr/min pour la nuit.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 10 mM MgCl2récolte les cellules par centrifugation à 3 000 x g pendant 10 min. égoutter les médias surnageants, et ajuster l' OD600 à 0,02 (1 x 107 UFC/mL) de feuilles de N. benthamiana et à 0,002 (1 x 10-6 UFC/mL) feuilles de Arabidopsis .
</li>
	<li>Pour le N. benthamiana, infiltrer la suspension de Pseudomonas dans la zone des feuilles où l' Agrobacterium transportant constructOPT sfGFP1-10 a été infiltrée 2 jours auparavant (comme dans l’étape 3.1.7). Pour le sfGFP1-10OPT transgéniques Arabidopsis, infiltrer la suspension de Pseudomonas dans 4 semaines deux courtes feuilles cultivées jour. Remarque : au moins trois usines sont nécessaires pour les répliques expérimentales.</li>
</ol>5. observation de sfGFP Signal par l’intermédiaire de la microscopie confocale (1 jour)
<ol><li>Découper le disque de la feuille de la Pseudomonas-inoculé des feuilles. À des points précis après infiltration de Pseudomonas, image deux disques foliaires de 2 cm2 de la centrale unique à l’aide d’un laser à balayage système confocal avec 40 X / 1.2 objectif à immersion d’eau NA C-Apochromat ou 63 X / 0,8 NA C-Apochromat immersion dans l’huile objectif. Pour éviter les cellules mortes, tuées par blessure, observer les cellules hors du trou de l’infiltration.</li>
	<li>Commencer l’observation à un réglage de faible puissance de laser à argon 488 nm. Augmenter la puissance du laser pour détecter les sfGFP. Remarque : Nous utilisons habituellement 2 à 15 % de l’intensité du laser pour détecter le signal de fluorescence. Cependant, la puissance du laser et fixer, qui doivent être ajustées selon système de microscopie de l’utilisateur. Ici, les filtres d’émission ont été mis à 520-550 nm. Les cellules mortes émettent souvent auto-fluorescence sous l’excitation de laser 488 nm. Par conséquent, comme témoin négatif, l’effecteur même sans l’étiquette de sfGFP11 devrait être infiltré et observée dans les mêmes conditions d’observation. En outre, excitation laser haute peut induire la chlorophylle autofluorescence. En conséquence, de régler l’intensité du laser en utilisant les cellules végétales de contrôle afin de ne pas d’induire la chlorophylle autofluorescence.<ol>
<li>Pour une contre-coloration de la paroi cellulaire, infiltrer l’iodure de propidium 20 mM (PI) dans le disque de feuilles à 5-10 min avant l’observation.</li>
		<li>Le noyau de coloration, submerger les disques foliaires dans paraformaldéhyde 0,1 % pendant 5 min, suivie par lavage à l’eau. Puis, s’infiltrer dans les 10 mM PI dans le disque de feuilles à 5-10 min avant l’observation microscopique. Répéter les expériences au moins trois fois. Remarque : Cette étape n’est pas critique, mais utile pour définir la localisation d’effecteur à la membrane plasmique ou le noyau. Si les effecteurs d’intérêt ont montré leur localisation dans un organite spécifique, utilisez un marqueur pour l’organite donnée pour confirmer la localisation de l’effecteur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Boyes, D. C., Nam, J., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+thaliana+RPM1+disease+resistance+gene+product+is+a+peripheral+plasma+membrane+protein+that+is+degraded+coincident+with+the+hypersensitive+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis thaliana RPM1 disease resistance gene product is a peripheral plasma membrane protein that is degraded coincident with the hypersensitive response.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15849-15854 (1998).</li>
<li>Nimchuk, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+fatty+acylation+drives+plasma+membrane+targeting+and+enhances+function+of+several+type+III+effector+proteins+from+Pseudomonas+syringae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic fatty acylation drives plasma membrane targeting and enhances function of several type III effector proteins from Pseudomonas syringae.</a> Cell. 101 (4), 353-363 (2000).</li>
<li>Gao, Z., Chung, E. H., Eitas, T. K., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+intracellular+innate+immune+receptor+Resistance+to+Pseudomonas+syringae+pv.+maculicola+1+%28RPM1%29+is+activated+at%2C+and+functions+on%2C+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Plant intracellular innate immune receptor Resistance to Pseudomonas syringae pv. maculicola 1 (RPM1) is activated at, and functions on, the plasma membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (18), 7619-7624 (2011).</li>
<li>Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable+strategy+for+high-throughput+GFP+tagging+of+endogenous+human+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).</li>
<li>Li, X., Yang, Q., Tu, H., Lim, Z., Pan, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+Agrobacterium-delivered+VirE2+in+recipient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of Agrobacterium-delivered VirE2 in recipient cells.</a> Plant J. 77 (3), 487-495 (2014).</li>
<li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+approaches+to+investigate+effector+translocation+into+host+cells+in+the+Ustilago+maydis%2Fmaize+pathosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Experimental approaches to investigate effector translocation into host cells in the Ustilago maydis/maize pathosystem.</a> Eur J Cell Biol. 94 (7-9), 349-358 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Le protocole décrit ici est utilisé pour surveiller la localisation précise des protéines effectrices injecté par la T3SS bactérienne dans la cellule végétale hôte à l’infection. Auparavant, le bibloc GFP a été utilisé comme un outil pour étudier la localisation sous-cellulaire des protéines de mammifères23,36, Salmonella T3E localisation et Agrobacterium VirE2 livraison par l’entremise de le T4SS dans la 37les cellules v...

Les plantes sont des organismes sessiles que rencontrent de nombreux pathogènes envahisseurs, y compris les bactéries, champignons, virus, insectes et nématodes tout au long de leur cycle de vie. Parmi les phytopathogènes, les bactéries pathogènes Gram négatifs telles que Pseudomonas spp. et Ralstonia spp., infecter leurs plantes hôtes en entrant par le biais de plaies ou d’ouvertures naturelles, comme les stomates et hydathode1. Pour coloniser les plantes hôtes avec succès, les bactéries pathogènes ont évolué pour développer une variété de facteurs de virulence2. Lorsque les bactéries envahissent une plante hôte, ils injectent une série de protéines de virulence — appelés effecteurs — directement dans les cellules végétales pour promouvoir leur pathogénicité. Ces effecteurs suppriment ou modulent l’immunité innée de la plante et de manipulent les processus cellulaires de l’hôte pour aboutir à la survie bactérienne3.
Bactéries pathogènes utilisent principalement un T3SS pour fournir des protéines effectrices directement dans hôte cellules4. Le T3SS ressemble à une seringue moléculaire avec un canal aciculaires raccordement d’une structure de protéine d’échafaudage entre l’intérieur et les membranes bactériennes externes vers le site de l’injection des cellules hôte5. Ce mécanisme de sécrétion de médiation T3SS effecteur (T3E) est bien conservée dans diverses bactéries pathogènes Gram négatifs de la plante mais aussi humaine. L’un des agents pathogènes végétaux de représentative, le P. syringae pv. Tomate DC3000 CRHC mutant qui a généralement un T3SS défectueux, a limité la croissance des plantes, probables en raison de l’incapacité de ce mutant pour supprimer entièrement les plantes l’immunité (par l’injection de protéines effectrices)6. Sur la translocation dans les cellules de l’hôte, effecteurs ciblent diverses protéines de l’hôte qui sont importants pour le système de cellule hôte, y compris les réactions de défense des plantes, la transcription de gènes, la mort cellulaire, du protéasome, trafic vésiculaire et hormone voies7 , 8 , 9 , 10. suivi de la localisation cellulaire des protéines effectrices dans les cellules de l’hôte est donc une cible attractive pour comprendre leurs fonctions en ce qui concerne la modulation de l’immunité de la plante.
La plupart des études de localisation de la T3Es ont employé la surexpression agrobactérie -négociée avec une protéine de fluorescence grande plante hôte9. Toutefois, la méthode d’expression hétérologue pour les gènes qui sont introduites dans d’autres espèces s’est avérée être mal localisées ou parfois dysfonctionnement11,12,13. En outre, plusieurs études ont révélé que les effecteurs bactériennes subissent aucune modification pour le ciblage approprié dans les cellules de l’hôte14,15,16,17. Par conséquent, transitoirement exprimé effecteurs dans le cytosol de l’usine de cellules ne peuvent pas être fonctionnellement ou quantitativement identiques pour les effecteurs qui sont livrés par le T3SS sur pathogène infection18. En outre, la fusion de grandes marques fluorescentes protéines effectrices susceptible de perturber le bon effecteur livraison et visualisation18,19. Par conséquent, ces approches pour analyser la fonction T3E ne reflètent pas pleinement la localisation native des effecteurs T3SS-sécrétée.
Une protéine fluorescente verte (GFP) est composée de 11 brins β-tonneau enfermant un brin central qui comprend un chromophore20. Waldo et al. signalé un système nouveau split-GFP qui consiste en une petite composante (GFP β chapelet 11 ; GFP11) et un grand fragment complémentaire (volet GFP β 1-10 ; GFP1-10)21. Les fragments de n’y pas de fluorescence par eux-mêmes mais sont fluorescents sur leur autoassociation lorsque les deux fragments sont très proches entre eux. Pour l’optimisation de l’efficacité de pliage de protéine, les variantes pliants robustes de la GFP, c'est-à-dire, sfGFP et sfGFPOPT, ont été développés par la suite le split GFP système20,21,22. Récemment, le seul acide aminé muté variantes de sfGFP1-10OPT- sfYFP1-10OPT et sfCFP1-10OPT- qui peut reconstituer avec un fragment de sfGFP11 et voir la fluorescence de jaune et cyan, respectivement, ont généré23 . En outre, sfCherry, un dérivé de mCherry, peut être divisé en fragments sfCherry1-10 et sfCherry11 de la même manière que sfGFP23.
Ce système a été adapté d’étiqueter et de suivre les effecteurs T3SS dans les cellules HeLa au cours de l’infection en utilisant les effecteurs de Salmonella24. Toutefois, il a été précédemment pas optimisé pour le système plante-bactérie pathogène hôte. Récemment, nous avons optimisé le système GFP split basé sur l’amélioration de sfGFP1-10OPT pour surveiller la localisation subcellulaire de la T3Es envoyées de P. syringae en usine cellules25. Afin de faciliter les études de localisation de la T3Es aux différents compartiments subcellulaires dans les cellules végétales, un ensemble de transgéniques Arabidopsis thaliana plantes ont été générés pour exprimer sfGFP1-10OPT dans les divers compartiments subcellulaires 25. par ailleurs, les plasmides portant une variété d’organite ciblées sfGFP1-10OPT pour l' Agrobacterium-médiation surexpression transitoire et les vecteurs sfGFP11-tag pour la prestation de base T3SS effecteur ont également générés. Les graines de diverses lignées transgéniques de Arabidopsis et les plasmides d’exprimer les T3Es d’intérêt peuvent provenir de sources mentionnées dans la Table des matières26,,27.
Dans le protocole suivant, nous décrivons un système optimisé pour suivre la dynamique des effecteurs envoyées par des bactéries dans les cellules de l’hôte en utilisant le système de sfGFP de split. Infection des plantes exprimant sfGFP1-10OPT avec transgéniques Pseudomonas plasmide recombinant sfGFP11 se traduit par une livraison de l’effecteur sfGFP11-tag de Pseudomonas dans la cellule hôte. Par conséquent, ces protéines sont reconstituées et effectuer des transferts à la cible (s) à des effecteurs spécifiques. Le Pseudomonas syringae pv. tomate CUCPB5500 souche dont 18 effecteurs sont supprimées, a été utilisé parce que cette souche ont montré peu ou pas la mort cellulaire dans les a. thaliana et N. benthamianas28. Cependant, tous les matériaux et les étapes décrites ici peuvent être remplacé ou modifié pour adapter le système de sfGFP de split pour enquête d’autres questions biologiques ou l’optimisation des conditions de laboratoire donné.

<table><tbody><tr><td><lignées transgéniques fortes>Arabidopsis</fortes></td><td></td><td></td><td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Surveillance spatio-temporelle des effecteurs de Pseudomonas syringae via la sécrétion de type III à l’aide de fragments de protéines fluorescentes divisées. Cellule végétale. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td></tr><tr><td>CYTO-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69831</td><td></td></tr><tr><td>NU-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69832</td><td></td></tr><tr><td>PT-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69833</td><td></td></tr><tr><td>MT-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69834</td><td></td></tr><tr><td>PX-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69835</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69836</td><td></td></tr><tr><td>GO-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69837</td><td></td></tr><tr><td>PM-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69838</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide sfGFP1-10OPT ciblant les organites</td><td></td><td></td><td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Surveillance spatio-temporelle des effecteurs de Pseudomonas syringae via la sécrétion de type III à l’aide de fragments de protéines fluorescentes divisées. Cellule végétale. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td></tr><tr><td>CYTO-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97387</td><td></td></tr><tr><td>NU-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97388</td><td></td></tr><tr><td>PT-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97389</td><td></td></tr><tr><td>MT-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97390</td><td></td></tr><tr><td>PX-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97391</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97392</td><td></td></tr><tr><td>GO-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97393</td><td></td></tr><tr><td>PM-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97394</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfCherry1-10</td><td>Addgene</td><td>97403</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfYFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97404</td><td></td></tr><tr><td>CYTO-sfCFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97405</td><td></td></tr><tr><td>sfGFP11-tagged Vecteur compatible avec la passerelle pour le système de distribution effecteur basé sur T3SS</td><td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. et Dinesh-Kumar, S. P. Surveillance spatio-temporelle des effecteurs de Pseudomonas syringae via la sécrétion de type III à l’aide de fragments de protéines fluorescentes divisées. Cellule végétale. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pBK-GW-1-2</td><td>Addgene</td><td>98250</td><td>pAvrRpm1 :GW :HA-sfGFP11 :AvrRpm1t ; Résistant à la kanamycine (25 μg/ml)</td></tr><tr><td>pBK-GW-1-4</td><td>Addgene</td><td>98251</td><td>pAvrRpm1 :GW :HA-2xsfGFP11 :AvrRpm1t ; Résistant à la kanamycine (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBK-GW-2-2</td><td>Addgene</td><td>98252</td><td>pAvrRpm1 :AvrRPM1sp :GW :HA-sfGFP11 :AvrRpm1t ; Résistant à la kanamycine (25 μg/ml)</td></tr><tr><td>pBK-GW-2-4</td><td>Addgene</td><td>98253</td><td>pAvrRpm1 :AvrRPM1sp :GW :HA-2xsfGFP11 :AvrRpm1t ; Résistant à la kanamycine (25 μg/ml)</td></tr><tr><td>pBG-GW-1-2</td><td>Addgene</td><td>98254</td><td>pAvrRpm1 :GW :HA-sfGFP11 :AvrRpm1t ; Résistant à la gentamycine (25 μg/ml)</td></tr><tr><td>pBG-GW-1-4</td><td>Addgene</td><td>98255</td><td>pAvrRpm1 :GW :HA-2xsfGFP11 :AvrRpm1t ; Résistant à la gentamycine (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBG-GW-2-2</td><td>Addgene</td><td>98256</td><td>pAvrRpm1 :AvrRPM1sp :GW :HA-sfGFP11 :AvrRpm1t ; Résistant à la gentamycine (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBG-GW-2-4</td><td>Addgene</td><td>98257</td><td>pAvrRpm1 :AvrRPM1sp :GW :HA-2xsfGFP11 :AvrRpm1t ; Résistant à la gentamycine (25 μg/ml)</td></tr><tr><td><fortes>souches bactériennes</fortes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens GV3101</td><td></td><td></td><td>Csaba Koncz et Jeff Schell, Le promoteur du gène 5 de l’ADN-TL contrôle l’expression tissulaire spécifique des gènes chimères portés par un nouveau type de vecteur binaire Agrobacterium. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Résistant à la gentamycine (50 μg/ml) et à la rifampicine (50 μg/ml)</td></tr><tr><td>Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500</td><td></td><td></td><td>Kvitko, B. H. et al. Les délétions dans le répertoire des gènes effecteurs de sécrétion de type III de Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 révèlent un chevauchement fonctionnel entre les effecteurs. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Résistant à la rifampicine (100 μg/ml)</td></tr><tr><td><fort>Composants du milieu</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fort>Milieu de germination pour plantes</fort></td><td></td><td></td><td>Ajouter 2,165g/L Murashige & Poudre Skoog, 10 g/L de saccharose dans de l’eau. Ajuster au pH 5,8 et ajouter 2,2 g/L de phytagel. Autocalve.</td></tr><tr><td>Murashige & Skoog medium comprenant des vitamines</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0222</td><td>Stocker à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td><Milieu fort>LB</fort></td><td></td><td></td><td>Ajouter 10 g/L de tryptone, 5 g/L d’extrait de levure, 10 g/L de NaCl à l’eau. Pour les milieux solides, ajouter 15 g/L de micro-agar. Autoclave.&nbsp ; Laisser refroidir la solution à 55 &deg ; C, et ajoutez un antibiotique si nécessaire.</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>BD Bioscience</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>BD Bioscience</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0520</td><td></td></tr><tr><td>Micro agar</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1002</td><td></td></tr><tr><td>King’s B media</td><td></td><td></td><td>10 g/L de protéase peptone #2, 1,5 g/L de K2HPO<>4, 15 g/L de gélose à l’eau. Autoclave. Refroidir à 55 &deg ; C et ajoutez 15 ml/L de glycérol stérile et 5 ml/L de MgSO4 au milieu. Ajoutez des antibiotiques si nécessaire.</td></tr><tr><td>Proteose peptone</td><td>BD Bioscience</td><td>212120</td><td></td></tr><tr><td>Anhydrus K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1551128 USP</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G1345</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Bioscience</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Milieu liquide <fort>mannitol-glutamate (MG) </fort></td><td></td><td></td><td>Ajouter 10 g/L de mannitol, 2 g/L d’acide L-glutamique, 0,5 g/L de KH2PO4, 0,2 g/L de NaCl et 0,2 g/L de MgSO4 à l’eau. Ajuster au pH 7</td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0803</td><td></td></tr><tr><td>Acide L-glutamique</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G0707</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NIST200B</td><td></td></tr><tr>Tampon <td></td><td></td><td>d’infiltration</td><td>10 mM MES (acide 2-(N-morpholino)-éthane sulfonique), 10 mM MgCl2, 150 &micro ; M acétosyringone. pH 5,6 ; Préparez un tampon frais avant utilisation.</td></tr><tr><td>MES</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1503</td><td>Préparez 100 mM (pH 5,6) de bouillon dans de l’eau. Filtrer la stérilisation.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Préparez 100 mM de stock dans l’eau. Autoclave.</td></tr><tr><td>Acétosyringone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td>Préparez un stock de 150 mM dans du DMSO.</td></tr><tr><td>Microscope confocal Équipements/matériaux</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>710 à balayage laser Système confocal</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio observer Z1 microscope inversé</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propidium</td><td>iodure ThermoFisher</td><td>P1304MP</td><td></td></tr></tbody></table>

protéine fluorescente verte bibloc pour visualiser les effecteurs livré de bactéries lors de l’infection

Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

Bactéries, parmi les plus importants agents causals de diverses maladies des plantes, sécrètent un ensemble de protéines effectrices dans la cellule de plante hôte pour subvertir le système immunitaire de plante. Au cours de l’infection effecteurs cytoplasmiques sont livrés dans le cytosol hôte via un type de système de sécrétion III (T3SS). Après l’accouchement dans la cellule végétale, les effecteurs cible le (s) spécifiques pour moduler les processus hôtes de cellule de survie et de la réplication de l’agent pathogène. Bien qu’il y a eu quelques recherches sur la localisation subcellulaire des protéines effectrices dans les cellules hôtes pour comprendre leur fonction dans la pathogénicité en utilisant des protéines fluorescentes, enquête sur la dynamique des effecteurs directement injectés des bactéries a été difficile en raison de l’incompatibilité entre la T3SS et des protéines fluorescentes.
Nous décrivons ici notre méthode récente d’un système de protéine fluorescente verte de superfolder (sfGFPOPT) split optimisé pour visualiser la localisation des effecteurs envoyées via la T3SS bactérienne dans la cellule hôte. Le sfGFP11 (11ème β-brin de sfGFP)-effecteur Taggé sécrétée par le biais de la T3SS peut être assemblé avec un organite spécifique cibléOPT sfGFP1-10 (1-10th β-brin de sfGFP) menant à l’émission de fluorescence sur le site. Ce protocole prévoit une procédure permettant de visualiser le signal de fluorescence sfGFP reconstitué avec une protéine effectrice de Pseudomonas syringae dans un organite particulier chez les plantes Arabidopsis et Nicotiana benthamiana .

La structure β-baril de GFP est composée d’onze brins β et peut être divisée en deux fragments, le brin deth 1-10 (GFP1-10OPT) et le brin deth (GFP11) 11. Bien qu’aucun des deux fragments fluorescents par eux-mêmes, sfGFP auto-assemblés peut émettre la fluorescence quand les deux fragments existent à proximité (Figure 1 a). Dans ce système, sfGFP1-10OPT-exprimant Arabidopsis ou N. benthamiana plant...

Approches protéine fluorescentes pour surveiller les effecteurs sécrétées par des bactéries dans les cellules hôtes sont difficiles. Cela est dû à l’incompatibilité entre protéines fluorescentes et le système de sécrétion de type III. Ici, un système GFP superfolder split optimisé est utilisé pour la visualisation des effecteurs sécrétées par des bactéries dans la cellule de plante hôte.

Protéine fluorescente verte bibloc pour visualiser les effecteurs livré de bactéries lors de l’Infection

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’interaction plante-microbe, telles que la façon dont les bactéries pathogènes peuvent perturber la condition optimale de leurs cellules végétales hôtes en utilisant des protéines appelées effecteurs sécrétées dans les cellules végétales. Le principal avantage de cette technique est que la protéine effectrice bactérienne est exprimée dans la cellule bactérienne à l’aide de son système d’expression natif, puis délivrée à la cellule végétale par le système de sécrétion bactérienne de type III. Pour commencer cette procédure, préparez les plantes de Nicotiana benthamiana et d’Arabidopsis thaliana comme indiqué dans le protocole de texte.Ensuite, utilisez l’électroporation standard pour transformer le gène porteur et effecteur du plasmide fusionné à l’étiquette sfGFP11 en souche de CUCPB5500 de tomate pathovar de Pseudomonas syringae. Le point temporel optimal et le niveau d’expression, ou reconstituer la sfGFP, dépendent vraiment de votre protéine effectrice. Nous recommandons d’optimiser les conditions d’inoculation ou d’observation.Répartissez doucement les cellules bactériennes transformées sur la surface

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Source : Lee, H. et. al., Système de protéines fluorescentes vertes divisées pour visualiser les effecteurs délivrés par les bactéries pendant l’infection. J. Vis. Exp. (2018)Cette vidéo présente une méthode de surveillance de l’infection bactérienne et de l’administration de protéines effectrices dans les cellules végétales à l’aide de la complémentation de la protéine fluorescente verte superfolder (sfGFP) combinée à la microscopie confocale. L’approche permet une visualisation précise de la...

Surveillance de l’infection bactérienne et de l’administration de protéines effectrices dans les cellules végétales

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