Protéine fluorescente verte bibloc pour visualiser les effecteurs livré de bactéries lors de l’Infection

Approches protéine fluorescentes pour surveiller les effecteurs sécrétées par des bactéries dans les cellules hôtes sont difficiles. Cela est dû à l’incompatibilité entre protéines fluorescentes et le système de sécrétion de type III. Ici, un système GFP superfolder split optimisé est utilisé pour la visualisation des effecteurs sécrétées par des bactéries dans la cellule de plante hôte.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’interaction plante-microbe, telles que la façon dont les bactéries pathogènes peuvent perturber la condition optimale de leurs cellules végétales hôtes en utilisant des protéines appelées effecteurs sécrétées dans les cellules végétales. Le principal avantage de cette technique est que la protéine effectrice bactérienne est exprimée dans la cellule bactérienne à l’aide de son système d’expression natif, puis délivrée à la cellule végétale par le système de sécrétion bactérienne de type III. Pour commencer cette procédure, préparez les plantes de Nicotiana benthamiana et d’Arabidopsis thaliana comme indiqué dans le protocole de texte.

Ensuite, utilisez l’électroporation standard pour transformer le gène porteur et effecteur du plasmide fusionné à l’étiquette sfGFP11 en souche de CUCPB5500 de tomate pathovar de Pseudomonas syringae. Le point temporel optimal et le niveau d’expression, ou reconstituer la sfGFP, dépendent vraiment de votre protéine effectrice. Nous recommandons d’optimiser les conditions d’inoculation ou d’observation.

Répartissez doucement les cellules bactériennes transformées sur la surface des plaques de gélose B de King’s. Ensuite, incubez les plaques à 28 degrés Celsius pendant deux jours. Après cela, inoculez une colonie bactérienne dans le milieu liquide King B avec un antibiotique approprié pour le vecteur.

Incuber toute la nuit à 28 degrés Celsius en secouant à 200 tr/min. Le lendemain, ajoutez du glycérol autoclavé au milieu inoculé jusqu’à une concentration finale de 50 % Conservez à moins 80 degrés Celsius. Pour commencer, transformez le plasmide en cellules GV3101 de la souche GV3101 d’Agrobacterium tumefaciens, comme indiqué dans le protocole textuel.

Cultivez les cellules sur un milieu LB Agar supplémenté à 28 degrés Celsius pendant deux jours. À l’aide d’une seule colonie du milieu LB Agar, inoculez 5 millilitres de milieu LB liquide supplémenté. Ensuite, faites pousser les cellules pendant la nuit à 28 degrés Celsius en secouant à 200 tr/min.

Après cela, centrifugez à 3000 G pendant 10 minutes pour récolter les cellules. Videz le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 1 millilitre de tampon d’infiltration fraîchement préparé. À l’aide d’un spectrophotomètre, déterminez la quantité de cellules Agrobacterium en mesurant la valeur de la densité optique à une absorbance de 600 nanomètres.

Ensuite, utilisez un tampon d’infiltration pour ajuster la DO 600 des cellules bactériennes à 0,5. Laissez la culture sur un basculant doux à température ambiante pendant une à cinq heures. Pour infiltrer les feuilles, utilisez une pointe de pipette de 10 microlitres pour percer un trou au centre de chaque feuille.

À l’aide d’une seringue sans aiguille de 1 millilitre, injectez soigneusement 500 microlitres de la suspension d’Agrobacterium dans la face adaxiale de la feuille. Essuyez la suspension bactérienne restante des feuilles et marquez la limite de la région infiltrée. Conservez les plantes infiltrées dans une chambre de croissance à 25 degrés Celsius et 60 % d’humidité pendant deux jours.

Appliquez l’antibiotique approprié sur la souche de Pseudomonas transformée à partir du stock de glycérol sur le milieu King’s B Agar. Incuber à 28 degrés Celsius pendant deux jours. Inoculer une boucle de cellules Pseudomonas dans un milieu liquide de mannitol glutamate.

Incuber la culture pendant la nuit à 28 degrés Celsius en secouant à 200 tr/min. Après cela, centrifugez à 3000 G pendant 10 minutes pour récolter les cellules. Videz le surnageant et remettez la pastille en suspension dans une solution de chlorure de magnésium de 10 millimolaires.

Ensuite, ajustez la densité optique à 0,02 pour les feuilles de Nicotiana benthamiana et à 0,002 pour les feuilles d’Arabidopsis. Pour les feuilles de Nicotiana benthamiana, infiltrez la suspension de Pseudomonas dans la même zone que l’Agrobacterium a été infiltrée deux jours plus tôt. Pour l’Arabidopsis transgénique, infiltrez la suspension de Pseudomonas dans deux feuilles courtes de quatre semaines cultivées à la journée.

Enfin, découpez un disque foliaire pour les feuilles inoculées à Pseudomonas. À des moments précis après l’infiltration de Pseudomonas, utilisez un système de balayage laser confocal pour imager deux disques de feuilles de deux centimètres carrés de la plante unique. Observez les cellules loin du trou d’infiltration pour éviter les cellules mortes tuées par les blessures.

Les effecteurs disloqués de la bactérie ne sont présents qu’en très petites quantités. Par conséquent, vous pouvez augmenter la puissance du laser et obtenir une émission de fluorescence pour détecter un signal fluorescent. Cependant, ne surchargez pas pour éviter de capturer un faux signal d’autofluorescence des cellules végétales.

Dans cette étude, une approche basée sur des protéines fluorescentes est utilisée pour surveiller les effecteurs sécrétés par les bactéries dans les cellules hôtes. Un balayage laser confocal d’une feuille de Nicotiana benthamiana trois heures après l’infection est montré ici. Les cellules exprimant uniquement une sfGFP optimisée avec AvrB ne montrent aucun signal fluorescent.

Cependant, les signaux GFP sont observés à partir des cellules infectées contenant AvrB, sfGFP11. Cela permet de vérifier que le complexe AvrB sfGFP11 est reconstitué avec une sfGFP optimisée dans le cytosol, puis se déplace vers la membrane plasmique. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de garder les matières végétales en bonne santé et de préparer une culture de bactéries fraîches pour les cellules actives.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’analyse du sang de résine peuvent être mises en œuvre pour comprendre la modification de la fausse traduction des protéines effectrices bactériennes dans les cellules végétales lors des réponses immunitaires des plantes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de visualiser l’administration de l’effecteur de type III dans les cellules végétales infectées. Les matières végétales et les cultures de bactéries doivent être éliminées conformément aux critères de votre laboratoire pour les déchets biologiques dangereux et n’oubliez pas de porter votre EPI.