La co-expression de multiples protéines chimériques fluorescentes Fusion de façon efficace dans les plantes

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie moléculaire et cellulaire des plantes, telles que : comment pouvons-nous fournir des protéines dans la cellule. Le principal avantage de cette technique est la grande efficacité de co-exprimer les protéines de fusion cellulaire dans un seul vecteur d’expression. Guitao Zhong, un étudiant diplômé de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Pour commencer, concevez les amorces pour le clonage moléculaire de fragments d’ADN comme décrit dans le protocole de texte. Amplifier les fragments d’ADN nécessaires à la construction des cassettes d’expression protéique semi-indépendantes par des réactions PCR standard avec leurs amorces correspondantes et une polymérase haute fidélité. Il s’agit notamment du promoteur, du rapporteur fluorescent, du gène cible et du terminateur.

Examinez la qualité des produits de PCR de première série en recherchant la dégradation de l’ADN et la contamination par électrophorèse de l’ADN à l’aide d’un gel d’agarose à 1 %. Quantifier les produits PCR à l’aide d’un spectrophotomètre. Le rapport entre les lectures à 260 et 280 nanomètres des produits PCR doit être compris entre 1,6 et 1,8.

Mélangez les fragments d’ADN conçus pour la même cassette d’expression protéique dans un tube PCR jusqu’à un volume final de cinq microlitres. À propos du mélange de DNS à partir de différentes données de cassette d’expression. Étant donné que l’égalité réduit l’efficacité de l’assemblage de l’ADN, en raison du nombre croissant de molécules d’ADN qui doivent être liées.

Maintenant, ajoutez 15 microlitres de mélange 2x master au mélange d’ADN de 5 microlitres et incubez à 50 degrés Celsius pendant 60 minutes. Amplifiez l’ensemble de la cassette d’expression protéique semi-indépendante par un deuxième cycle de PCR. Utilisez 0,5 à un microlitre du produit de la réaction d’assemblage isotherme du premier tour comme modèle dans les amorces les plus externes.

Utilisez une unité de polymérase haute fidélité dans un volume de réaction de 50 microlitres pendant 30 cycles, suivie d’une extension finale à 68 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, linéarisez le vecteur de squelette d’expression protéique final POC 18 et le vecteur CAMBIA 1300, en ajoutant quatre unités de petit dans un volume de réaction final de 10 microlitres. Ces vecteurs sont conçus pour l’expression transitoire des protéines et la transformation génétique.

Incuber la digestion de restriction pendant une à deux heures à 25 degrés Celsius. Après la digestion, inactivez l’enzyme de restriction en l’incubant à 65 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, mélangez des molécules d’ADN équimolaire de cassettes d’expression de protéines et de vecteur final linéarisé dans un volume de réaction final de cinq microlitres.

Enfin, effectuez le deuxième tour de recombinaison de l’ADN en mélangeant la réaction avec 15 microlitres de tampon principal 2x et en incubant à 50 degrés Celsius pendant 60 minutes. Pour préparer les cellules de suspension BY-2 de tabac pour le bombardement, filtrez 30 millilitres de cellules BY-2 cultivées pendant 3 jours sur un morceau de papier filtre autoclavé de 70 millilitres à l’aide d’une pompe à vide, en réglant la pression de vide à 40 millibars. Pendant ce temps, ajoutez plusieurs gouttes de milieu de culture liquide à cellules BY-2 dans une boîte de Pétri.

Transférez le papier filtre avec les cellules BY-2 dessus dans la boîte de Pétri. Pour préparer les plantes juvéniles d’Arabidopsis au bombardement, préparez des échantillons de plantes âgées de sept jours comme indiqué dans le protocole textuel. Ensuite, transférez-les dans un rectangle au centre d’une nouvelle plaque moyenne MS demi-force pour augmenter l’efficacité du bombardement.

Veillez à ne pas chevaucher les plantes lors du transfert et de la pose sur l’assiette. Ajoutez plusieurs gouttes de milieu liquide MS demi-fort à la surface des plantes ou des tissus pour préserver l’humidité et éviter le dessèchement des plantes pendant les étapes restantes. Pour enrober les particules d’or d’ADN plasmidique, essayez d’abord de bien agiter la solution de microsupport d’or pendant trois minutes.

Maintenant, ajoutez 25 microlitres de particules d’or dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et faites un vortex pendant 10 secondes. Ajoutez 10 microlitres de spermidine à 25,46 milligrammes par litre et vortex pendant 10 secondes. Ensuite, ajoutez cinq microlitres d’un microgramme par microlitre d’ADN plasmidique et faites un tourbillon pendant trois minutes.

Enfin, ajoutez 25 microlitres de solution de chlorure de calcium à 277,5 milligrammes par litre et agitez pendant une minute. Faites tourner les microsupports d’or à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse à vitesse maximale pendant cinq secondes. Après la centrifugation, égouttez-le soigneusement hors du surnageant sans déranger la pastille.

Ensuite, lavez le granulé avec 200 microlitres d’éthanol absolu et remettez le granulé en suspension en tourbillonnant pendant cinq à 10 secondes. Une fois le gain atteint, faites tourner les micro-supports d’or à vitesse maximale pendant cinq secondes et retirez l’éthanol. Remettez en suspension les particules d’or dans 18 microlitres d’éthanol absolu.

Ensuite, aliquotez six microlitres de suspension de particules au milieu de trois microtransporteurs et laissez-les sécher à l’air. Pour transférer l’ADN dans les cellules et les plantes par bombardement de particules, réglez d’abord le système d’administration des particules comme détaillé dans le protocole texte. Ensuite, bombardez les cellules ou les plantes sur la plaque d’agromedium trois fois à trois positions différentes.

Gardez les cellules et les plantes bombardées dans l’obscurité dans la chambre de croissance des plantes pendant six à 72 heures avant d’observer les signaux fluorescents. Réglez la chambre de croissance des plantes sur 24 heures d’obscurité et 22 degrés Celsius. Transférez les plantes juvéniles ou les cellules en suspension sur une lame de verre conventionnelle et placez délicatement une lame de couverture sur le dessus pour l’imagerie par microscopie confocale à balayage laser standard.

En utilisant les paramètres répertoriés dans le protocole texte, excitez les protéines marquées GFP à 485 nanomètres et détectez la fluorescence à 525 nanomètres. Pour les protéines marquées RFP, exciter à 585 nanomètres et détecter à 608 nanomètres. Enfin, calculez le rapport de collocalisation des signaux fluorescents comme décrit dans le protocole texte.

La co-expression d’arabidopsis VSR-2 et d’arabidopsis SCAMP4 dans les cellules BY-2 du tabac a été obtenue par bombardement de particules et montre des localisations correctes. RFP arabidopsis VSR-2 présente un motif ponctué, qui était distinct de la localisation membranaire plasmique d’arabidopsis SCAMP4-GFP, avec quelques points ponctués cytosoliques. De plus, les plantes transgéniques d’arabidopsis qui co-expriment arabidopsis SCAMP4-GFP et RFP arabidopsis VSR-2 ont été générées par transformation médiée par des agrobactéries.

Les localisations subcellulaires de la co-expression des deux protéines chimériques dans les cellules racinaires et les cellules ciliées racinaires sont montrées. Conformément aux études précédentes, le traitement de l’arabidopsis transgénique a provoqué des compartiments prévacualaires marqués RFP arabidopsis VSR-2, formant une petite structure en forme d’anneau. Alors que le traitement avec la prépliline A induisait l’arabidopsis SCAMP GFP a marqué l’agrégation du réseau G transgold.

En tant que contrôle négatif, peu de signal autofluorescent est observé dans les cellules BY-2 du tabac et les cellules racines et poils racinaires d’arabidopsis en appliquant les mêmes paramètres de collecte d’images. Cette méthode peut donner un aperçu de la localisation subcellulaire des protéines. Il peut également être appliqué à l’étude des protéines en direction.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire végétale. Pour exporter facilement les localisations subcellulaires et l’interaction spatiale des protéines dans la cellule végétale vivante. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la transformation médiée par TEP et le croisement génétique peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la co-expression de plusieurs protéines de fusion chez les plantes.

N’oubliez pas que travailler avec le bombardement peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que des protections oculaires doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.