Analyse de AtHIRD11 désordre intrinsèque et la liaison vers les Ions métalliques par électrophorèse capillaire et l’électrophorèse capillaire affinité

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la tectonique des protéines de désordre intrinsèque telles que les changements de conformation dus à la liaison du fer métallique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle nécessite très peu de matériel et que les résultats peuvent être obtenus très rapidement. Matthias Stein, un étudiant diplômé de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Pour commencer, utilisez un coupe-verre sur une plaque de verre pour couper un capillaire de silice fondue nue avec un revêtement externe en polyamide et un diamètre intérieur de 50 microns en longueurs de 33 et 30 centimètres. À l’aide d’un stylo, marquez le milieu d’une fenêtre de détection d’un centimètre de large à une distance de 24,5 centimètres d’une extrémité du capillaire pour l’expérience EGC et à 21,5 centimètres d’une extrémité du capillaire pour l’expérience ACE. À l’aide d’un chalumeau, brûlez le revêtement extérieur en polyamide 0,5 centimètre avant et après chaque marque.

De même, utilisez le chalumeau pour enlever un centimètre de revêtement aux deux extrémités des capillaires. Ensuite, utilisez de l’éthanol et un mouchoir pour nettoyer les extrémités des capillaires et les fenêtres de détection. Installez un capillaire dans le système CE avec la fenêtre de détection près de la sortie.

Après avoir préparé les solutions, conformément au protocole de texte, utilisez une solution de chlorure de calcium de 250 micromolaires pour remplir une seringue de 10 millilitres. Fixez ensuite un filtre PVDF de 0,2 micron à la seringue et poussez 2 millilitres de la solution à travers le filtre pour la jeter. Utilisez le chlorure de calcium restant dans la seringue pour remplir 10 flacons jusqu’au volume maximum autorisé.

Étiquetez chaque flacon comme un flacon d’entrée de solution de chlorure de calcium de 250 micromolaires. Ensuite, à l’aide de la solution de chlorure de calcium, remplissez 10 flacons à moitié. Marquez chacun comme un flacon de sortie de solution de chlorure de calcium de 250 micromolaires.

Ensuite, avec d’autres solutions contenant des sels métalliques, remplissez les flacons de la même manière. De plus, pour chaque paire de flacons d’entrée et de sortie, utilisez 30 tampons Tris micromolaires pour préparer un ensemble similaire de flacons d’entrée et de sortie. Avec 60 marqueurs EOF d’acétanilide micromolaire, remplissez 10 flacons.

Utilisez ensuite la solution d’échantillon d’un milligramme par millilitre pour remplir un flacon. Après avoir préparé l’analyse, selon le protocole de texte, exécutez la séparation en injectant hydrodynamiquement la solution d’échantillon pour les expériences CGE et en appliquant 0,1 bar pendant quatre minutes à l’entrée. Ensuite, appliquez moins 16,5 kilovolts et une pression de 2,0 bars aux deux extrémités du capillaire pendant 25 minutes.

Après avoir préparé la méthode pour les mesures sans ligands, préparez la méthode pour les mesures avec ligands en utilisant d’abord une solution d’EDTA à 0,1 molaire pour rincer le capillaire à 2,5 bar pendant 1 minute. Utilisez ensuite de l’eau déminéralisée pour rincer le capillaire. Ensuite, équilibrez le capillaire en utilisant une solution de ligand pour le rincer à 2,5 bars pendant 1,5 minutes.

Ensuite, injectez la solution d’acétanilide à 0,05 bar pendant 6 secondes et remplacez les flacons d’entrée et de sortie par le ligand contenant des flacons tampons. Appliquez 0,05 bar pendant 2,4 secondes afin de pousser la solution d’acétanilide plus loin à partir de l’extrémité du capillaire. Appliquez 10,0 kilovolts pendant 6 minutes et détectez le pic d’acétanilide actif à une longueur d’onde de 200 nanomètres.

Après avoir rincé le capillaire avec de l’eau désionisée EDTA et la solution de ligand, comme précédemment, injectez l’échantillon de protéines et remplacez les flacons d’entrée et de sortie par des flacons de ligand frais contenant des flacons tampons. Alternativement, répétez la prise de mesures avec et sans ligands. Ensuite, répétez la méthode en utilisant les solutions de ligand alcalino-terreux.

Enfin, utilisez les solutions suivantes pour effectuer la même méthode. Ensuite, calculez la variation des rapports de taille de charge pour les différentes interactions entre les ions métalliques des protéines. Voici l’électrophérogramme de l’échantillon AtHIRD11 obtenu lors des expériences CGE.

La taille du peptide augmente de gauche à droite. Le pic numéro quatre a la plus grande masse et indique la protéine intacte. Les pics plus petits, deux et trois, représentent des impuretés plus petites.

Cette figure représente l’électrophérogramme de l’acétanilide pendant les expériences ACE. La solution d’acétanilide ne présente qu’un seul pic élevé puisqu’elle ne doit pas contenir d’impuretés. Le temps de détection du maximum de crête indique le temps de migration du flux électroosmotique et est utilisé pour le calcul de l’interaction.

Cet électrophérogramme de l’échantillon AtHIRD11 lors de l’expérience ACE a été réalisé en l’absence de SDS et d’ions métalliques. Outre les deux impuretés de l’électrophérogramme CGE, au moins cinq pics, liés à la protéine elle-même, sont présents. Une évaluation graphique des décalages temporels de migration mesurés en présence des différents ions métalliques pour le pic six est présentée ici.

Il est représenté par la valeur calculée Delta R sur RF. Chaque résultat indique l’intensité d’un décalage par sa valeur et son signe, comme indiqué par le changement global en charge des complexes d’ions métalliques protéiques. Une fois maîtrisée, la technique peut être réalisée pour un partenaire d’interaction en huit heures, y compris l’interaction CGE si elle est exécutée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de changer les solutions protéiques pour les mesures à long terme, car les produits de dégradation peuvent augmenter avec le temps et de changer les solutions Tris Buffer afin d’obtenir des résultats plus précis.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de couper et de nettoyer un capillaire, ainsi que de mettre en place une méthode d’électrophorèse capillaire d’affinité, afin d’évaluer le comportement de liaison des protéines désordonnées intrinsèques.