Techniques de spectrométrie de mobilité-masse d'ion pour déterminer la structure et les mécanismes de la reconnaissance d'ion de métal et de l'activité de Redox des Oligopeptides de liaison de métal

La spectrométrie de masse de mobilité iion, ou IM-MS, identifie les différents ions produits du redox dépendant du pH et de la réaction liant le méthyle des peptides. Avec la modélisation moléculaire de leur structure tertiaire, la corrélation métallique peut être déterminée. IM-MS peut résoudre chacun des ions du produit et identifier leur composition moléculaire en mesurant simultanément leur masse à la charge et les heures d’arrivée et en se rapportant à leur stoichiométrie, état de protonation, et la structure conformationnelle.

Le développement de classes de peptides chélateurs métalliques aidera à mener à des thérapies pour les maladies associées au déséquilibre des ions métalliques, tels que menkes et wilson' la maladie de s, les cancers, et la maladie d’Alzheimer. Pour commencer, nettoyez soigneusement le tube d’entrée ESI et le capillaire à aiguilles avec environ 500 microlitres d’acide acétique glaciaire molaire de 0,1 molaire, 0,1 hydroxyde d’ammonium molaire et, enfin, de l’eau déionisée. Utilisez les conditions natives ESI-IM-MS décrites dans le protocole textuel pour recueillir les spectres négatifs et positifs de l’ion IM-MS de la solution poly-DL-alanine de 10 ppm pendant 10 minutes chacune.

Pipette 200,0 microlitres de la méthanobactine alternative de 0,125 millimolaire, ou solution d’amb, dans un flacon de 1,7 millilitre. Diluer avec 500 microlitres d’eau déionisée et bien mélanger la solution. Ajustez le pH de l’échantillon à 3,0 en ajoutant 50 microlitres de solution d’acide acétique molaire de 1,0.

Ajouter 200,0 microlitres de l’ion métallique de 0,125 millimlaire à l’échantillon ajusté au pH. Ajouter ensuite de l’eau déionisée pour produire un volume final de 1,00 millilitre de l’échantillon. Bien mélanger et laisser l’échantillon équilibrer pendant 10 minutes à température ambiante.

À l’aide d’une seringue nasale émoussée, prendre 500 microlitres de l’échantillon et recueillir les spectres négatifs et positifs de l’ion ESI-IM-MS pendant cinq minutes chacun. Utilisez les 500 microlitres restants de l’échantillon pour enregistrer son pH final à l’aide d’une électrode micro pH calibrée. Répétez ces étapes, sauf pour ajuster le pH à pH quatre, cinq, six, sept, huit, neuf ou dix, en ajoutant de nouveaux volumes d’acide acétique ou de solutions hydroxyde d’ammonium.

Recueillir les spectres négatifs et positifs de l’ion ESI-IM-MS des solutions qui en résultent pendant 10 minutes chacune. À partir des spectres IM-MS, identifiez quelles espèces chargées de la méthanobactine alternative sont présentes en les faisant correspondre à leurs modèles théoriques d’isotopes de masse à charge. Pour ce faire, ouvrez MassLynx et cliquez sur Chromatogram pour ouvrir la fenêtre Chromatogram.

Rendez-vous dans le menu Fichier et ouvrez-le pour localiser et ouvrir le fichier de données IM-MS. Extraire le spectre IM-MS en cliquant à droite, en faisant glisser à travers le chromatogramme, et en libérant. La fenêtre du spectre s’ouvrira, montrant le spectre IM-MS.

Dans la fenêtre spectre, cliquez sur Outils et Modèle isotopique. Dans la fenêtre de modélisation des isotopes, entrez la formule moléculaire de l’espèce d’amb, cochez la boîte à ion chargée Show et entrez l’état de charge. Cliquez sur OK. Répétez ce processus pour identifier toutes les espèces du spectre de la GI-SP et enregistrer leur gamme d’isotopes de masse à charge.

Pour chaque espèce de chapelure, séparez toutes les espèces coïncidentes de masse à charge et extrayez leurs distributions de temps d’arrivée, ou ATD, en utilisant leurs modèles isotopiques de masse à charge pour les identifier. Ouvrez DriftScope et cliquez sur Fichier et Ouvert pour localiser et ouvrir le fichier de données IM-MS. Utilisez la souris et cliquez à gauche pour zoomer sur le modèle isotopique de masse à charge de l’espèce de mie.

Utilisez l’outil de sélection et le bouton de la souris gauche pour sélectionner le modèle isotopique. Cliquez sur le bouton Accepter la sélection actuelle. Pour séparer toute espèce coïncidente de masse à charge, utilisez l’outil de sélection et le bouton de la souris gauche pour sélectionner l’heure atd alignée avec le modèle isotopique de l’espèce de mie.

Cliquez sur le bouton Accepter la sélection actuelle. Pour exporter l’ATD, allez à File, Export to MassLynx. Sélectionnez ensuite Conserver le temps de dérive et enregistrez le fichier dans le dossier approprié.

Dans la fenêtre Chromatogram de MassLynx, ouvrez le fichier exporté enregistré. Cliquez sur Processus, Intégrez-vous à partir du menu, cochez la case d’intégration ApexTrack Peak et cliquez sur OK. Enregistrez le centroïde et la zone intégrée de l’ATD. Après avoir répété ce processus pour tous les fichiers de données IM-MS d’amb et de poly-DL-alanine sauvegardés, utilisez l’ATD intégré pour toutes les espèces extraites de mie des ions positifs ou négatifs à chaque point de titration pour normaliser à une échelle de pourcentage relative.

Pour ce faire, entrez l’identité de l’espèce amb et leur ATD intégré à chaque pH dans une feuille de calcul. Pour chaque pH, utilisez la somme des ATD intégrés pour normaliser l’ATD de chaque espèce d’amb à une échelle de pourcentage. Tracez le pourcentage d’intensité de chaque espèce de mie par rapport au pH pour montrer comment la population de chaque espèce varie en fonction du pH.

À l’aide d’une feuille de calcul, convertir les sections transversales de collision d’ions négatifs et positifs poly-DL-alanine mesurés en gaz tampon d’hélium en sections transversales de collision corrigées. Ensuite, convertir les temps moyens d’arrivée des étalons poly-DL-alanine et des espèces d’amb en temps de dérive. Branchez les temps de dérive des calibrants poly-DL-alanine par rapport à leurs sections transversales de collision corrigées.

Ensuite, à l’aide d’un ajustement de régression des moins carrés, déterminez les valeurs A prime et B, où un premier est la correction des paramètres de température, de pression et de champ électrique, et B compense l’effet non ligneux de l’appareil IM. À l’aide de ces valeurs A prime et B avec la valeur des temps de dérive centroïdes, déterminez leurs sections transversales de collision corrigées et leurs sections transversales de collision. Cette méthode fournit des sections transversales de collision pour les espèces peptidiques avec des erreurs absolues estimées à environ 2% En utilisant Gaussian avec GaussView, et le niveau de théorie B3LYP LanL2DZ, localiser la géométrie optimisé conforms pour tous les types possibles de coordinations de l’espèce observée de masse à charger amb.

Le niveau de théorie B3LYP LanL2DZ est composé des trois fonctionnelles hybrides périphériques Becke, de l’ensemble de base Dunning et des potentiels du noyau d’électrons. Extraire les analyses thermochimiques de chacun des conformistes optimisés du fichier de sortie gaussien et calculer leurs sections transversales théoriques de collision à l’aide de la méthode Lennard-Jones à l’échelle ion du programme Sigma. À partir des plus basses conformités d’énergie libre, déterminez quel conforme présente la section transversale de collision Lennard-Jones qui est d’accord avec la section transversale mesurée par la COLLISION IM-MS.

Ce processus identifie la structure tertiaire et le type de coordination pour les conformistes observés dans l’expérience. La modélisation moléculaire exige la comparaison de l’énergie libre et des sections transversales de collision des conformistes avec différents emplacements de chélage métallique, des liaisons de peptide de cis et de trans, des ponts de sel, la liaison d’hydrogène, et les interactions de pi-cation. L’étude im-MS de la méthanobactine alternative on a prouvé qu’elle a chélaté les ions de cuivre et de zinc d’une manière pH-dépendante, mais par différents mécanismes de réaction et sites de coordination.

La liaison zinc(II) a été observée à un pH supérieur à six, formant principalement un seul complexe chargé négativement, indiquant que le zinc(II) était tétrahedrally coordonné par les deux imidazoles et deux thiolates. La liaison cuivre(II) était accompagnée des thiols formant un pont de disulfide. À un pH supérieur à six, le complexe de cuivre (II) chargé négativement unique s’est formé, indiquant que l’imidazole et deux azotes d’amide déprotonés coordonnaient le cuivre(II)Cependant, au-dessous du pH six, ajoutant le cuivre(II) a également formé le seul cuivre positivement chargé (I)complexe, aussi bien que le seul cuivre positivement chargé (II)complexe au-dessus du pH six.

Les études im-MS d’amb deux et d’amb quatre montrent également que les réactions de cuivre ont donné des produits qui ont différé dans le nombre des ponts inter-ou intramoléculaires de disulfide, le nombre de cuivre (I)ou de cuivre(II)ions, et le nombre de sites de déprotonation, qui ont changé en fonction du pH. Le résultat im-MS avec la modélisation moléculaire a prouvé que les méthanobactines alternatives pourraient coordonner jusqu’à trois cuivre (I)ions par l’intermédiaire des groupes de thiolate, d’imidazoles, et de carboxylate. Les paramètres instrumentaux im-MS doivent être soigneusement choisis pour conserver la stoichiométrie des peptides, les distributions de charge et les structures conformationnelles, telles que décrites dans le texte.

La combinaison d’un plus large éventail de tailles qui influenceront la coordination des métaux tels que la tyrosine à l’acide aspartique permettra une meilleure compréhension de la relation entre la structure et la fonction. L’IM-MS avec modélisation moléculaire sont devenus des techniques alternatives pour accélérer la cristallographie et la spectroscopie RM pour déterminer les structures conformationnelles des protéines, de l’ADN, des lipides et de leurs complexes.