Essai de décalage de mobilité électrophorétique pour la détection de complexes facteur de transcription-ADN

Les protéines régulatrices, comme les facteurs de transcription, reconnaissent et se lient à des séquences d’ADN spécifiques dans les régions promotrices, régulant ainsi l’expression des gènes.

Pour détecter des interactions spécifiques entre le facteur de transcription et l’ADN à l’aide du test de déplacement de mobilité électrophorétique, commencez par un tube contenant un facteur de transcription souhaité et des sondes d’ADN courtes, infrarouges et fluorescentes spécifiques dans un tampon de liaison. Incuber dans l’obscurité, en évitant le photoblanchiment par colorant.

La force ionique et le pH du tampon fournissent des conditions appropriées pour que le facteur de transcription identifie et lie des séquences de liaison spécifiques sur la sonde d’ADN. Les ions magnésium dans le tampon stabilisent davantage les complexes protéine-ADN.

Ajoutez un colorant de chargement approprié au mélange, ce qui aide à visualiser la progression de l’électrophorèse. Chargez ce mélange et les sondes d’ADN dans les puits d’un gel de polyacrylamide préfabriqué et non dénaturant.

Effectuez l’électrophorèse dans l’obscurité.

Le champ électrique appliqué fait que les sondes d’ADN de faible poids moléculaire, non liées et chargées négativement se déplacent à travers le gel vers des anodes chargées positivement. Cependant, les grands complexes protéine-sonde d’ADN – avec un poids moléculaire plus élevé – migrent lentement, entraînant une migration retardée et un déplacement de la mobilité de l’ADN dans le gel.

Après l’électrophorèse, balayez le gel à l’aide d’un système d’imagerie infrarouge, en visualisant les sondes d’ADN marquées par un colorant fluorescent infrarouge

Une bande de sonde d’ADN libre se trouve au bas du gel, tandis que les complexes protéine-ADN apparaissent sous la forme d’une bande décalée sur le gel, indiquant la formation d’un complexe protéine-ADN.

Préparez 1 millilitre de tampon de liaison 5X en mélangeant du Tris-HCl, du chlorure de sodium, du chlorure de potassium, du chlorure de magnésium, de l’EDTA, du DTT, du BSA et de l’eau doublement distillée.

Avant de mettre en place les réactions de liaison, pré-exécutez le gel de polyacrylamide natif à 5 % dans du TBE 0,5X et du glycérol à 2,5 % pour éliminer toutes les traces de persulfate d’ammonium à 80 volts pendant 30 minutes à 1 heure ou jusqu’à ce que le courant ne varie plus avec le temps.

Ensuite, mélangez 4 microlitres de tampon de liaison 5X, 80 à 200 nanogrammes de protéine A purifiée, 1 microlitre de sonde conjuguée à colorant 0,1 micromolaire et de l’eau distillée deux fois. Incuber le mélange à température ambiante dans l’obscurité pendant 15 minutes.

Après l’incubation, chargez toute la réaction de liaison sur le gel et faites fonctionner le gel à 10 volts par centimètre à la distance souhaitée. Couvrez l’appareil à gel avec de l’aluminium pour garder le gel dans l’obscurité autant que possible.

Nettoyez le lit du scanner d’un système d’imagerie infrarouge avec de l’eau distillée. Essuyez les plaques de verre contenant le gel et placez-les sur le lit du scanner. Ouvrez le logiciel d’imagerie infrarouge et cliquez sur l’onglet « Acquérir ».

Pour les plaques plus épaisses, utilisez les réglages « 700 » pour « Canal », « Auto » pour « Intensité », « 84 micromètres » pour « Résolution », « Moyen » pour « Qualité » et « 3,5 millimètres » pour « Décalage de mise au point ». Sélectionnez la zone occupée par le gel sur le scanner. Enfin, cliquez sur « Démarrer » pour commencer l’analyse.