Dosage par électrochimiluminescence pour la quantification des niveaux de protéines cibles dans le lysat cérébral

Pour la détection quantitative d’une protéine spécifique dans le lysat cérébral de souris à l’aide de l’électrochimiluminescence, ECL, immunoessai, commencez par une plaque de dosage multi-puits.

Les puits comprennent des électrodes de travail et des contre-électrodes conductrices, complétant le circuit électrique. Une couche diélectrique sépare les électrodes, améliorant ainsi la sensibilité du dosage.

Ajoutez des anticorps monoclonaux primaires de souris contre la protéine cible dans les puits. Les électrodes de travail, avec une plus grande capacité de liaison, facilitent l’immobilisation des anticorps sur celles-ci.

Incuber avec une solution contenant des protéines, en se liant aux surfaces de liaison restantes du puits, réduisant ainsi les interférences de fond.

Ajouter du lysat de fraction nucléaire de cerveau de souris. La protéine cible du lysat se lie spécifiquement aux anticorps monoclonaux.

Ajoutez des anticorps polyclonaux non marqués, en reconnaissant et en se liant aux épitopes de la protéine, qui sont liés aux anticorps monoclonaux primaires sur l’électrode. Ajoutez des anticorps secondaires spécifiques marqués avec un complexe de ruthénium, se liant aux anticorps non marqués. Ajouter un tampon approprié contenant un tensioactif — fournissant un environnement de génération d’ECL approprié — et de la tripropylamine, TPA.

Placez la plaque multipuits dans le système de détection ECL. Lors de l’application du potentiel à travers les électrodes, le complexe de ruthénium lié aux anticorps s’oxyde. En même temps, le TPA s’oxyde et perd spontanément un proton.

Le radical TPA résultant réduit le complexe de ruthénium oxydé à son état excité. Lorsqu’il se relâche jusqu’à son état fondamental, le complexe de ruthénium émet un photon détecté par le photodétecteur.

L’intensité lumineuse mesurée est représentative de la concentration spécifique en protéines du lysat.

Sortez la plaque à 96 puits du réfrigérateur et retirez le papier d’aluminium. Retirez la solution d’enrobage d’anticorps des puits en la jetant dans un conteneur à déchets. Ensuite, tapotez l’assiette sur une serviette en papier pour retirer toute solution restante.

Ensuite, ajoutez 125 microlitres de solution de blocage dans chaque puits. Ensuite, scellez à nouveau la plaque avec une feuille adhésive. Placez la plaque sur un agitateur de microplaques orbital, réglé à 800 tr/min, et incubez-la pendant 90 minutes à température ambiante.

Décongeler sur de la glace, un flacon de solution mère de protéines MeCP2 ou TAT-MeCP2, des lysats de cerveau de souris et des lysats HDF. Diluer la solution mère de protéines dans des tubes propres, comme décrit dans le tableau 2 du manuscrit.

Ensuite, diluez les échantillons de lysat. Pour les lysats de cerveau de souris, utilisez 1 à 20 microgrammes par 25 microlitres de tampon de lyse. Pour le lysat HDF, ajouter 0,25 à 1 microgramme par 25 microlitres de tampon de lyse.

Une fois que la plaque de 96 puits a été incubée pendant 90 minutes, retirez la solution de blocage des puits en la jetant dans un conteneur à déchets. Ensuite, tapotez l’assiette sur une serviette en papier pour retirer toute solution restante. Ensuite, lavez la plaque 3 fois avec 150 microlitres de solution de lavage, en ajoutant la solution de lavage et en la retirant immédiatement.

Ajoutez 25 microlitres d’étalons et d’échantillons dans les puits de la plaque de 96 puits. Fermez la plaque et incubez-la pendant quatre autres heures à température ambiante, en secouant constamment 800 tr/min.

Décongeler l’anticorps de détection non marqué, polyclonal de lapin anti-MeCP2, sur de la glace. À l’aide d’une solution de diluant de dosage, diluez l’anticorps dans un rapport de 1:6000. Lorsque la plaque de 96 puits a fini d’incuber sur l’agitateur, retirez les étalons et les échantillons en jetant la plaque dans un conteneur à déchets. Ensuite, tapotez l’assiette sur une serviette en papier pour retirer toute solution restante.

Lavez la plaque 3 fois avec 150 microlitres de solution de lavage en ajoutant la solution de lavage et en la retirant immédiatement. Ajoutez 25 microlitres de solution d’anticorps de détection non étiquetée dans chaque puits avec le pipeteur multicanaux. Fermez la plaque et incubez-la pendant 1 heure à température ambiante en secouant constamment à 800 tr/min.

Obtenez l’anticorps secondaire spécifique du réfrigérateur et placez-le sur de la glace. Diluer l’anticorps secondaire dans une solution de diluant de dosage et mélanger délicatement.

Pour retirer l’anticorps de détection libre et non étiqueté de la plaque à 96 puits, glissez-le dans le récipient à déchets, puis tapotez la plaque sur une serviette en papier. Après avoir lavé la plaque 3 fois, comme décrit précédemment, ajoutez 25 microlitres d’anticorps secondaires dans chaque puits avec le pipetteur multicanaux. Fermez la plaque et incubez-la pendant 1 heure à température ambiante en secouant constamment à 800 tr/min.

Retirez l’anticorps secondaire libre en le jetant dans le récipient à déchets et en tapotant l’assiette sur une serviette en papier, puis lavez l’assiette trois fois comme décrit précédemment.

Dans chaque puits de la plaque, ajoutez 150 microlitres de tampon de lecture d’or à base de tris 1X avec tensioactif, contenant de la tripropylamine comme co-réactif pour la génération de lumière.

Pour éviter de produire des bulles d’air, utilisez des techniques de pipetage inversé. Placez la plaque à 96 puits sur la plate-forme de microplaques avec un système de détection par électrochimiluminescence.

À l’aide de la caméra CCD intégrée, commencez immédiatement à capturer des données. Enregistrez le nombre de signaux qui correspond à des unités lumineuses relatives et qui est directement proportionnel à l’intensité de la lumière.