Microscopie électronique à transmission pour quantifier la distribution du glycogène dans les muscles squelettiques humains

Le glycogène, un polymère de glucose ramifié, est une réserve d’énergie dans les compartiments intermyofibrillaires subcellulaires, intramyofibrillaires et sous-sarcolemmaux du muscle squelettique humain.

Pour quantifier la distribution subcellulaire du glycogène à l’aide de la microscopie électronique à transmission, TEM, on obtient du tissu musculaire squelettique humain isolé. Fixer avec du glutaraldéhyde pour préserver la structure des tissus. Postfixez le tissu dans une solution de tétroxyde d’osmium et de ferrocyanure de potassium.

Le complexe réduit osmium-ferrocyanure se lie aux groupes hydroxyles dans le glycogène, améliorant ainsi le contraste des particules de glycogène dans le muscle. De plus, les membranes et le réticulum sarcoplasmique - un organite lié à la membrane - sont colorés.

Déshydrater les tissus en augmentant les concentrations d’éthanol. S’enfoncer dans la résine pour former un bloc solide. Obtenir des sections ultra-minces avec des fibres musculaires orientées longitudinalement ; transfert sur les réseaux TEM.

Immergez les grilles dans de l’acétate d’uranyle, une solution de métaux lourds. Les ions uranyle se lient aux lipides et aux protéines chargés négativement, ce qui les rend denses en électrons. Coloration avec une solution de citrate de plomb.

Les ions plomb se lient aux régions colorées à l’osmium, y compris les particules de glycogène, améliorant ainsi le contraste. Ils se lient également aux régions ayant réagi à l’acétate d’uranyle, intensifiant ainsi l’opacité des électrons.

Au cours de l’imagerie TEM, lorsque les faisceaux d’électrons traversent le tissu, les régions denses en électrons colorés, y compris le glycogène, dispersent plus d’électrons, tandis que les régions non colorées transmettent des électrons.

Dans l’image TEM à contraste élevé produite, les particules de glycogène apparaissent distinctes et sombres ; les régions non colorées apparaissent plus claires, facilitant la visualisation et la quantification de la distribution subcellulaire du glycogène dans les muscles.

Isolez un petit échantillon de la biopsie musculaire ou du muscle entier, qui a un diamètre maximal de 1 millimètre dans toutes les directions et qui est plus long longitudinalement que transversalement.

Placez l’échantillon dans le tube contenant la solution de fixation primaire froide. Conservez-le à 5 degrés Celsius pendant 24 heures. Ensuite, lavez l’échantillon 4 fois dans un tampon de cacodylate de sodium de 0,1 molaire. À l’aide de pipettes de transfert, retirez le tampon utilisé du tube, en laissant l’échantillon intact, et ajoutez le tampon frais. Fixez ensuite l’échantillon avec du tétroxyde d’osmium à 1 % et du ferrocyanure de potassium à 1,5 % dans un tampon de cacodylate de sodium à 0,1 molaire pendant 120 minutes à 4 degrés Celsius.

Rincez l’échantillon deux fois à l’eau bidistillée à température ambiante. Déshydrater en l’immergeant dans une série graduée d’éthanol à température ambiante. Infiltrez l’échantillon avec des mélanges classés en oxyde de propylène et en résine épsidesidique à température ambiante en utilisant les rapports de volume mentionnés.

Le lendemain, encastrez les échantillons dans de la résine éposidique 100 % fraîche dans des moules et polymérisez à 60 degrés Celsius pendant 48 heures.

Montez le bloc d’un échantillon sur le support d’ultramicrotome. Coupez le bloc sur la surface avec une lame de rasoir pour atteindre le niveau des tissus. Montez un couteau diamanté devant l’échantillon et alignez la surface de l’échantillon parallèlement au couteau.

Produisez une section semi-mince de 1 micromètre d’épaisseur avec le couteau diamanté pour vérifier l’orientation de l’échantillon. Colorer la section semi-mince avec du bleu de toluidine pour l’observation en microscopie optique. Ensuite, coupez davantage le bloc pour réduire la zone d’intérêt afin d’obtenir des sections ultra-minces appropriées.

Découpez des sections ultra-minces de 60 à 70 nanomètres d’épaisseur à l’aide d’un deuxième couteau diamanté. Collectez 1 à 2 sections sur des grilles de cuivre à un trou à l’aide d’une boucle parfaite. Pour contraster les sections, plongez les grilles dans une solution d’acétate d’uranyle pendant 20 minutes, puis lavez les grilles dans de l’eau doublement distillée, puis plongez les grilles dans du citrate de plomb pendant 15 minutes, et lavez à nouveau les grilles dans de l’eau doublement distillée.

Allumez le microscope électronique à transmission, l’ordinateur et le logiciel d’enregistrement d’images. Enregistrez des images numériques à l’aide d’une caméra CCD numérique à balayage lent et du logiciel d’imagerie associé. Après avoir inséré la grille avec plusieurs sections dans la platine du microscope, tamisez d’abord la grille à faible grossissement pour choisir les sections de la meilleure qualité et déterminer la direction des fibres musculaires.

Ensuite, faites la mise au point de l’image à un grossissement supérieur à 30 000, avec le faisceau centré sur une fibre périphérique dans la section, et enregistrez des images avec un temps d’exposition de 1 seconde au grossissement souhaité. Assurez-vous que les images sont réparties sur la longueur et la largeur de la fibre dans un ordre aléatoire mais systématique pour obtenir des résultats non biaisés, et répétez l’imagerie jusqu’à ce que 6 à 10 fibres soient imagées.

Importez des images dans imageJ en cliquant sur Fichier, puis sur Ouvrir. Définissez l’échelle globale pour qu’elle corresponde à la taille d’origine de l’image en cliquant sur Analyser, puis sur Définir l’échelle. Pour zoomer à 100 %, cliquez sur Image, allez dans Zoom, puis cliquez sur Avant.

Mesurez l’épaisseur d’un disque Z par image de l’espace myofibrillaire, à l’aide de l’outil Ligne droite du menu Outils, et calculez l’épaisseur moyenne du disque Z de chacune des 6 à 10 fibres. Utilisez l’outil Ligne segmentée pour mesurer la longueur de la myofibrille la plus externe, visible juste en dessous de la région sous-sarcolemmale.

Pour insérer une grille, cliquez sur Analyser, sélectionnez Outils, puis sélectionnez Grille. Définissez maintenant la surface par point à 32 400 nanomètres carrés. Comptez le nombre d’occurrences dans la longueur disponible, dans les 12 images sous-sarcolemmales où une croix touche le glycogène sous-sarcolemmal.

Insérez une grille en cliquant sur Analyser, puis sélectionnez Outils, puis Grille, et définissez la surface par point à 160 000 nanomètres carrés. Comptez le nombre de coups dans les 12 images myofibrillaires, où une croix frappe l’espace intramyofibrillaire.

Là encore, pour insérer une grille, cliquez sur Analyser, sélectionnez Outils, puis sélectionnez Grille. Maintenant, fixez l’aire par point à 3 600 nanomètres carrés. Comptez le nombre de coups dans les 12 images myofibrillaires où une croix frappe le glycogène intramyofibrillaire.

Insérez une grille en cliquant sur Analyser, puis sélectionnez Outils, puis Grille, et définissez la surface par point à 32 400 nanomètres carrés. Comptez le nombre de résultats dans les 12 images myofibrillaires où un croisement frappe le glycogène intermyofibrillaire.

À l’aide de la grille de 32 400 nanomètres carrés pour choisir au hasard les particules de glycogène, commencez par le carré supérieur gauche et déplacez-vous vers la gauche si nécessaire. À l’aide de l’outil Ligne droite, mesurez le diamètre de 5 particules de glycogène choisies au hasard de chaque bassin pour chacune des 12 images afin d’obtenir une moyenne de 60 particules par bassin et par fibre.