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Pour quantifier les interférons bioactifs de type I, tels que l’interféron alpha et l’interféron bêta, dans un échantillon d’essai, prenez une plaque multipuits contenant des cellules rapporteures modifiées. Ces cellules expriment le gène rapporteur de la phosphatase alcaline embryonnaire sécrétée, SEAP, sous le contrôle du promoteur inductible par l’interféron alpha et bêta.
Ajouter l’échantillon d’essai contenant une concentration inconnue d’interféron de type I. Pipetez une gamme de concentrations d’interféron de type I humain vers d’autres puits, qui servent de contrôles standard. Couver.
L’interféron de type I dans le puits de test se lie à un récepteur de surface cellulaire spécifique, activant les Janus kinases. Ces protéines kinases phosphorylent les transducteurs de signal et les activateurs des protéines de transcription, STAT, qui se dimérisent et forment un complexe avec un facteur de régulation de l’interféron spécifique.
Lorsqu’il pénètre dans le noyau, le complexe se lie à une séquence d’ADN spécifique dans le promoteur inductible de l’interféron alpha et bêta, activant la transcription du gène SEAP et produisant les enzymes SEAP, qui sont sécrétées dans le milieu.
Transférez le milieu contenant du PAED dans des puits à plaques multipuits ayant un substrat spécifique au PAED. Le PAED hydrolyse le substrat rose, produisant un produit de couleur violet-bleu.
À l’aide d’un lecteur de microplaques, mesurer l’absorbance du produit dans les puits d’essai et les puits étalons, indiquant les niveaux de PAED et la concentration d’interféron de type I.
À partir de la courbe d’interféron standard de type I tracée, déterminez la concentration d’interféron bioactif de type I dans l’échantillon d’essai.
Pour mesurer l’interféron bioactif de type I à l’aide de cellules rapporteures d’interféron alpha/bêta HEK-Blue, il faut d’abord plaquer les cellules rapporteures à une densité de 50 000 cellules par puits dans une plaque à fond plat de 96 puits jusqu’à un volume final de 180 microlitres. Ensuite, ajoutez 20 microlitres du surnageant de co-culture fraîchement récolté dans chaque puits en double. Incluez un ensemble de commandes standard internes et incubez la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 18 à 22 heures.
Pour déterminer les niveaux de phosphatase alcaline libérés par les cellules rapporteures, ajoutez 180 microlitres de solution QUANTI-Blue dans chaque puits d’une nouvelle plaque à fond plat. Ensuite, ajoutez 20 microlitres de cellules surnageantes interféron-alpha/bêta HEK-blue induites dans chaque puits, et incubez la plaque à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que la couleur se développe dans les puits de contrôle d’interféron standard.
La solution de QUANTI-Blue passe du rose au bleu-violet en présence de l’enzyme. Enfin, à l’aide d’un spectrophotomètre, on évalue les niveaux de phosphatase alcaline sécrétée à 620 à 655 nanomètres et on détermine la concentration d’interféron de type I par extrapolation à partir de la partie linéaire de la courbe étalon de l’interféron.