Induction de l’entérocolite nécrosante dans un modèle d’entérocolite épithéliale humaine

Obtenir des cryptes dérivées de tissus de l’intestin grêle humain - des invaginations tubulaires contenant des cellules souches et divers types de cellules épithéliales.

Ajoutez les cryptes intestinales dans une matrice de sous-sol réfrigérée.

Transférez ce mélange dans une plaque multipuits, créant un dôme tridimensionnel.

Ajouter le milieu de culture et incuber.

Les cellules souches s’auto-organisent, prolifèrent et se différencient en plusieurs types de cellules intestinales, formant des entérosphères.

Au fil du temps, les entérosphères se transforment en entéroïdes – des structures tridimensionnelles qui s’auto-renouvellent, ressemblant aux cryptes intestinales.

Ajoutez des lipopolysaccharides, ou LPS, une endotoxine bactérienne, dans le puits contenant l’entéroïde et incuber.

molécules de LPS se lient au récepteur de type Toll dans l’entéroïde, initiant une réponse pro-inflammatoire, entraînant l’accumulation d’espèces réactives de l’oxygène. Cela déclenche une cascade d’événements menant à l’apoptose.

Par conséquent, l’intégrité de l’entéroïde est compromise, ce qui entraîne la pénétration du LPS dans la lumière, intensifiant encore la réponse inflammatoire.

Cela imite le développement de l’entérocolite nécrosante, une inflammation sévère des intestins des nourrissons prématurés.

Au moment du prélèvement dans la salle d’opération, placez l’échantillon de tissu de l’intestin grêle humain dans du DPBS froid. Lavez l’échantillon dans le DPBS froid jusqu’à ce qu’il soit débarrassé du sang et des selles.

Conservez l’échantillon dans un milieu RPMI 1640 à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à être isolé dans la crypte. Lorsque vous êtes prêt à continuer, vérifiez à nouveau que l’échantillon est exempt de selles et de sang. À l’aide de ciseaux à dissection délicats, retirez tout excès de graisse ou de clips et d’agrafes chirurgicaux. Pesez l’échantillon et visez un morceau d’environ 0,75 à 2,5 grammes.

Ensuite, coupez le tissu en morceaux de 0,5 centimètre et placez-les dans un tube contenant 30 millilitres de tampon chélateur #1. Agitez à basse vitesse pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, filtrez le tissu à travers une crépine à cellules de 100 micromètres et jetez le flux.

Ajouter le tissu filtré dans un tube contenant 30 millilitres de tampon chélateur #2. Agitez à basse vitesse pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Filtrez le tissu à travers un filtre de 100 micromètres et jetez le liquide à écoulement.

Après cela, décongelez 500 microlitres de matrice de membrane basale sur de la glace pour une utilisation ultérieure. Ajoutez un peu de tissu à 10 millilitres de DMEM froid dans un tube conique de 50 millilitres et secouez vigoureusement à la main pendant 10 secondes. Filtrez cette suspension à travers une crépine à cellules de 100 micromètres et collectez le flux. Gardez ce tube sur de la glace.

Ajoutez un peu de tissu à 10 millilitres supplémentaires de DMEM froid dans un tube conique séparé de 50 millilitres et secouez vigoureusement à la main pendant 10 secondes. Filtrez cette suspension à travers une crépine à cellules de 100 micromètres et collectez le flux.

Répétez ce processus deux fois de plus jusqu’à ce qu’il y ait quatre tubes coniques contenant un flux continu étiqueté de un à quatre. Ensuite, filtrez la solution dans le tube numéro un à travers une crépine à cellules de 100 micromètres et transférez le flux dans un tube conique de 15 millilitres également étiqueté numéro un. Répétez ce processus pour les tubes deux à quatre.

Centrifugez les tubes de 15 millilitres à 200 fois g et à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Dans une hotte à flux laminaire, retirez le surnageant de chaque tube et jetez-le. Évitez de perturber le nuage de tissu immédiatement au-dessus de la pastille, même si cela signifie laisser un certain surnageant derrière vous. Dans chaque tube, pipetez lentement de haut en bas pour mélanger la pastille avec le surnageant restant.

Transférez le mélange de chaque tube dans un seul tube conique de 2 millilitres et centrifugez à 200 fois g et à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Après cela, retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 500 microlitres de matrice de membrane basale prédécongelée.

À l’aide d’une pointe de pipette réfrigérée, appliquez 50 microlitres de cette suspension au centre d’un puits dans une plaque de 24 puits. Cet échantillon doit avoir la forme d’un dôme. Répétez ce processus d’application neuf fois pour remplir 10 puits au total.

Transférez la plaque à 24 puits dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour permettre la polymérisation. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de milieu mini-intestinal humain complet dans chaque puits. Poursuivez l’incubation dans les mêmes conditions en veillant à remplacer ce milieu tous les deux jours.