Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
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Prenez une plaque multipuits contenant des dilutions en série du composé testé, un antibiotique aminoglycoside.
Ajoutez une suspension de Mycobacterium tuberculosis – une bactérie pathogène – dans les puits et incuber.
Dans le cytoplasme, le composé testé se lie à la sous-unité ribosomique 30S mycobactérienne, inhibant la synthèse normale des protéines et conduisant finalement à la mort mycobactérienne.
Après l’incubation, ajoutez de la résazurine - un colorant hydrosoluble faiblement fluorescent - aux cultures. Couver.
À l’intérieur de mycobactéries métaboliquement actives viables, les enzymes déshydrogénases réduisent la résazurine de couleur bleue en une résorufine fluorescente de couleur rose.
À l’aide d’un lecteur de plaques de fluorescence, mesurez l’intensité de fluorescence de la résorupine dans les puits.
Une faible valeur d’intensité de fluorescence avec des concentrations croissantes de composés d’essai suggère ses effets cytotoxiques contre les mycobactéries.
Pour effectuer un dosage de la résazurine, cultivez M. tuberculosis en 7H9ADST jusqu’à la phase mi-logarithmique. Diluer la culture avec du 7H9ADST à une DO600 de 0,01. Utilisez 7H9ADST pour diluer les composés à deux fois les concentrations d’essai, et aliquotez 100 microlitres de chaque composé dilué dans chaque puits d’une plaque transparente à 96 puits.
Transférez 100 microlitres de suspension bactérienne diluée dans chaque puits. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié pendant 5 jours. Dissoudre 10 milligrammes de résazurine dans 100 millilitres d’eau déminéralisée et stériliser la solution par filtration. Ajouter 30 microlitres de solution de résine dans les puits. Ensuite, incubez les cellules pendant 48 heures.
La croissance bactérienne est indiquée par une conversion de couleur du bleu au rose. Effectuer une analyse quantitative selon le protocole textuel.