Un test phénotypique microscopique pour la quantification des mycobactéries intracellulaires adaptées au criblage à haut débit /haute teneur

L’objectif global de cette procédure est de mesurer l’effet des modulateurs de phénotypes tels que le silençage du gène de l’hôte ou l’impact de petites molécules sur mycobacterium tuberculosis, la réplication intracellulaire. Ceci est accompli en distribuant d’abord de petites molécules et des plaques à 384 puits ou en transectant des cellules avec de l’ARNi et en transfect en complexe. L’étape suivante consiste à infecter les cellules avec une protéine fluorescente verte exprimant mycobacterium tuberculosis ou G-F-P-M-T-B, à ajouter des cellules à la petite molécule contenant des puits et à incuber la microplaque pendant cinq jours.

Pour l’approche ARNi, ajoutez des cellules sur un complexe de transfects d’ARNi contenant des puits. Incuber la microplaque pendant trois jours, puis infecter les cellules avec G-F-P-M-T-B exprimant mycobacterium tuberculosis. Après la coloration des cellules, l’étape finale consiste à lire les plaques à l’aide d’un microscope confocal automatisé.

En fin de compte, la microscopie à fluorescence automatisée suivie d’une analyse basée sur l’image est utilisée pour mesurer les changements dans la croissance intracellulaire G-F-P-M-T-V. Le principal avantage de cette technique par rapport à la méthode existante comme la formation de colonies est qu’elle épargne une longue période d’incubation et permet un débit plus élevé. La démonstration de cette procédure sera assurée par Christophe Keval ou SONG et trois post-doctorants de mon équipe de recherche.

Les protocoles de criblage des banques d’ARN SI et des banques de composés utilisent des cultures de VD de MYCOBACTERIUM tuberculosis H 37 âgées de deux semaines. Pour préparer la suspension bactérienne G-F-P-M-T-B, centrifugez d’abord la culture à 4 000 G pendant cinq minutes, jetez les surnageants Resus, suspendez la culture dans le DPBS et centrifugez-la à nouveau de cette manière. Lavez la culture trois fois avec du DPBS.

Après le troisième lavage, jetez le supernat et remettez en suspension la pastille bactérienne dans 10 millilitres de 10 % FBS contenant du milieu RPMI 1640. Laissez la suspension pendant une heure à température ambiante pour permettre aux agrégats bactériens de sédimenter. Collectez le supernat bactérien et mesurez le DO à 600 nanomètres et la fluorescence GFP.

À l’aide d’un lecteur de microplaques pour déterminer la concentration bactérienne, la DO à 600 nanomètres doit être comprise entre 0,6 et 0,8. Calculez le titre de la suspension à l’aide d’une droite de régression de référence, en affichant la valeur RFU en fonction de la valeur CFU générée avant les expériences sur une autre culture préparée dans les mêmes conditions. Une concentration typique est d’un fois 10 à huit bactéries par millilitre.

Commencez cette procédure en suspendant la banque d’ARN SI séchée qui est stockée dans 96. Boîtes mères avec un tampon X-S-I-R-N-A à une concentration de deux micromolaires. Transférez 10 microlitres du mélange dans chaque puits d’une plaque fille de 384 puits, transférez 2,5 microlitres d’ARN SI de chaque puits de la plaque fille dans une plaque d’essai de 384 puits vers la même plaque d’essai.

Ajoutez 2,5 microlitres d’IRNA à témoin négatif et positif à leurs puits respectifs. Si la plaque fille n’est pas utilisée, scellez-la immédiatement avec un joint en aluminium pelable. La plaque scellée peut être stockée à moins 20 degrés Celsius pendant au moins six mois et éventuellement jusqu’à deux à trois ans selon l’IRNA.

Recommandations du fabricant de la bibliothèque. Préparez les réactifs de transfection en les diluant dans un X-D-P-B-S pour obtenir une solution suffisante pour fournir 0,1 microlitre pour chacun. Bien pré-incuber la solution de transfection diluée à température ambiante pendant cinq minutes.

Ajouter 7,5 microlitres de la solution de transfection diluée dans chaque puits de la plaque de dosage de 384 puits et incuber pendant 30 minutes à température ambiante dans chaque puits de la plaque de dosage à 40 microlitres de pneumocytes humains de type deux, A 5 4 9 cellules en suspension dans le milieu RPMI 1640 complété par 10 % de sérum de veau fœtal. Maintenez les cellules pendant une période d’incubation de trois jours à 37 degrés Celsius dans une atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone. Ces cellules se divisent toutes les 24 heures, ce qui signifie qu’environ 12 000 cellules se trouvent dans chaque puits trois jours après la transfection.

Trois jours après si. La transfection de l’ARN d’un 5 à 49 cellules prépare une suspension bactérienne MTBH 37 RV GFP. Comme démontré précédemment.

La suspension doit contenir 2,4 fois 10 à six bactéries par millilitre, ce qui correspond à une multiplicité d’infection de cinq. Retirez le milieu dans la plaque de dosage à 384 puits et ajoutez 25 microlitres de suspension bactérienne par puits. Incuber la plaque d’analyse de 384 puits à 37 degrés Celsius pendant cinq heures dans une atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone.

Après cinq heures. Retirez le milieu et lavez doucement les cellules trois fois avec un milieu RPMI complété par 10 % de FBS pour tuer les bactéries extracellulaires restantes. Traitez les cellules de chaque puits avec 50 microlitres.

Un milieu frais R-P-M-I-F-B-S contenant 50 microgrammes par millilitre d’Amikacin. Incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure dans une atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone. Enfin, retirez le milieu contenant de l’amikacine et ajoutez 50 microlitres de milieu frais RPMI complété par 10 % de FBS par. Puits.

Incuber la plaque d’essai à 37 degrés Celsius pendant cinq jours dans une atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone avant d’être dépisté par microscopie confocale. Pour commencer cette procédure, décongelez une plaque mère de 384 puits contenant la bibliothèque de composés solubilisée dans du DMSO à 100 % à température ambiante, transférez 0,5 microlitre des composés de la plaque mère à une plaque fille de 384 puits contenant 10 microlitres par puits de RPMI 1640. Milieu complété par 10 % FPS lors de la prochaine récolte de macrophages humains primaires de six jours à quatre fois 10 à cinq cellules par millilitre dans RPMI 1640.

Moyen complété avec 10 % FPS et 50 nanogrammes par millilitre. Les cellules primaires humaines recombinantes MCSF incubent les cellules primaires diluées avec des basia à différents MOI allant de un à cinq en suspension avec une légère agitation à 90 tr/min pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Lavez les cellules infectées par centrifugation à 350 GS pendant cinq minutes pour éliminer les bactéries extracellulaires.

Resus suspend les granulés en RPMI 1640. Milieu complété par 10 % FPS et centrifugeuse. Encore une fois, répétez cette opération, lavez deux fois après le dernier lavage.

Resus suspend les cellules infectées dans le milieu RPMI 1640 complété par 10 % FBS et 50 microgrammes par millilitre. Amikacin : incuber la suspension en secouant légèrement pendant une heure à 37 degrés Celsius, centrifuger à 350 GS pendant cinq minutes. Retirez le milieu contenant de l’amikacine et lavez les cellules infectées avec du RPMI 1640 complet.

Moyen complété par 10 % de FBS et 50 nanogrammes par millilitre. MCSF humain recombinant. Répétez ce lavage une fois.

Ajoutez 40 microlitres par puits de la suspension de macrophages infectés à la même plaque de dosage de 384 puits préparée précédemment, qui contient déjà 10 microlitres de dilutions du composé. La concentration finale de DMSO dans chaque puits est maintenant de 1 %Incuber les plaques de test pendant cinq jours à 37 degrés Celsius dans une atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone avant de dépister par microscopie confocale pour la banque d’ARN SI. Criblage avant l’acquisition de l’image, ajouter à chaque puits de la plaque de dosage 10 microlitres de 30 microgrammes par millilitre de DPI fraîchement préparés dans du PBS et incuber pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius.

Avant l’acquisition de l’image, colorez les cellules vivantes avec un colorant fluorescent rouge lointain pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Chargez les plaques de test dans un microscope confocal automatisé. Réglez les paramètres d’exposition, enregistrez la fluorescence DPI à l’aide d’un laser d’excitation à 405 nanomètres avec un filtre d’émission à 450 nanomètres.

Enregistrez la fluorescence GFP à l’aide d’un laser d’excitation à 488 nanomètres avec un filtre d’émission à 520 nanomètres. Sélectionnez les puits et les champs de chaque puits à acquérir, qui sont ensuite appelés schémas et sous-modèles. Les paramètres génèrent le fichier d’expériences à l’aide des paramètres définis et exécutent l’acquisition automatique.

Dans ce cas, quatre images différentes du même puits et du même champ sont enregistrées, transférant des images vers un serveur distant. Ensuite, les images sont évaluées à l’aide du logiciel d’analyse d’images acapella 2.6 pour le criblage de l’ARN SI. Chaque champ contient deux canaux ou couleurs.

Vert pour les bactéries et bleu pour la cellule. Les noyaux détectent les noyaux cellulaires du canal DAPI à l’aide d’un algorithme de détection de noyaux et la zone bactérienne du canal GFP à l’aide d’un algorithme de propriétés d’intensité des pixels. En fusionnant les canaux et en comptant le nombre de pixels partagés par les bactéries et les cellules, les bactéries intracellulaires sont quantifiées.

Les résultats finaux exprimés en moyenne des quatre champs sont la surface bactérienne totale, le nombre total de cellules, le pourcentage de cellules infectées et la surface bactérienne par cellule. Pour le criblage des composés, chaque champ contient deux canaux ou couleurs, vert pour les bactéries et rouge lointain pour la cellule. Les noyaux et le cytoplasme détectent la zone cellulaire du canal rouge lointain et la zone bactérienne du canal GFP à l’aide d’un algorithme de propriétés d’intensité de pixel.

En fusionnant les canaux et en comptant le nombre de pixels partagés par les bactéries et les noyaux, les bactéries intracellulaires sont quantifiées. Les résultats finaux exprimés en moyenne des quatre champs sont l’aire bactérienne totale, l’aire cellulaire totale, l’aire totale des bactéries intracellulaires et le rapport entre l’aire bactérienne intracellulaire et l’aire totale des cellules. Les résultats représentatifs du criblage à haut débit de l’ARN SI à l’échelle du génome sont présentés ici, le fait de réduire au silence l’expression de din one avec l’ARN SI a conduit à une diminution de la quantité de mycobactéries intracellulaires dans 5 à 49 cellules.

Comme le montrent ces images confocales représentatives de 5 à 49 cellules transfectées avec de l’ARNi non cible ou avec de l’ARN SI spécifique de din un et infectées par la GFP exprimant le MTB pendant cinq jours. GFP MT BH 37 RV a été visualisé en vert et les cellules en rouge. Le nombre de cellules et la charge intracellulaire G-F-P-M-T-B-H 37 RV ont été déterminés à l’aide d’un logiciel d’analyse basé sur l’image.

Ce graphique montre le pourcentage de cellules infectées a 5 49 dans cinq répétitions d’ARNA brouillés représentés par des cercles bleus et din un ARNA représenté par des cercles rouges. Après trois jours de réduction au silence et cinq jours d’infection, le pourcentage de cellules infectées est réduit de moitié en un réduit au silence a 5 49 cellules par rapport aux cellules transfectées avec l’ARNA brouillé non cible. Une normalisation basée sur l’échantillon de l’ARN SI ciblé DIN un par rapport au brouillage a été appliquée pour définir le score Z.

Une moyenne Z-score d’environ moins 15 a été obtenue pour le SI, un DIN ciblé. Les trois astérisques représentent une valeur P inférieure à 0,0001. Ces résultats indiquent que DIN one peut être utilisé comme un contrôle positif pour le si, un criblage pour découvrir d’autres nouveaux facteurs de l’hôte impliqués dans la colonisation du MTB et des pneumocytes qui pourraient avoir le même phénotype que celui avec l’IRNA dins dans le criblage des composés à haut teneur.

L’efficacité du composé sur la croissance bactérienne intracellulaire a été évaluée en établissant une courbe dose-réponse ou DRC et en normalisant avec les composés positifs et négatifs de référence. Dans cet exemple, des macrophages primaires humains infectés par une GFP exprimant la souche MTBH 37 RV ont été incubés avec 1 % de DMSO comme témoin négatif ou avec des concentrations croissantes de deux composés de référence, l’isid, l’INH et la rifampicine. RIF. Les macrophages sont marqués avec un colorant de fluorescence rouge et la couleur verte indique le MTB L’analyse des images de fluorescence confocale des macrophages humains infectés a révélé que les composés actifs ont un impact sur la réplication intracellulaire du MTB dans les cellules hôtes, entraînant une diminution de la charge mycobactérienne, ce qui correspond à la zone du signal GFP dans les cellules.

Le rapport entre la surface bactérienne intracellulaire et la surface cellulaire totale a été calculé, puis tracé en fonction de la concentration des composés pour générer la DRC. La DRC du composé a été normalisée à celle de 1 % de DMSO, le témoin négatif et de 0,1 microgramme par millilitre pour le témoin positif. Ces courbes permettent de déterminer à la fois la concentration nécessaire pour inhiber 50 % de la colonisation bactérienne et la concentration minimale nécessaire pour inhiber 99 % de la réplication bactérienne Un semestre.

Cette technique peut être réalisée en 10 heures réparties comme suit, deux heures pour la transfection cellulaire ou la préparation de composés, six heures pour l’infection cellulaire et la distribution dans une microplaque et deux heures pour le maintien d’une acquisition d’image. Ceci sur une période de huit jours, n’oubliez pas que travailler avec mycobacterium tuberculosis peut être extrêmement important en tant qu’artiste et que des actions précoces, telles que le port d’un équipement de protection individuelle, y compris un masque, doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure.