Un test phénotypique microscopique pour la quantification des mycobactéries intracellulaires adaptées au criblage à haut débit /haute teneur

L'objectif général de cette procédure est de mesurer l'effet de modulateurs de phénotype, tels que la silenciation de gènes de l'hôte ou l'impact de petites molécules, sur la réplication intracellulaire de Mycobacterium tuberculosis. Ceci est réalisé en dispensant d'abord des petites molécules dans des plaques de 384 puits ou en transfectant des cellules avec de l'irna pour former des complexes. L'étape suivante consiste à infecter les cellules avec une souche de Mycobacterium tuberculosis exprimant la protéine verte fluorescente (GFP-MTB), à ajouter les cellules dans les puits contenant les petites molécules, puis à incuber la microplaque pendant cinq jours.

Pour l'approche ARNi, ajouter les cellules dans des puits contenant des complexes de transfection ARNi. Incuber la microplaque pendant trois jours, puis infecter les cellules avec une mycobactérie tuberculeuse exprimant la protéine GFP-MTB. Après coloration des cellules, la dernière étape consiste à lire les plaques à l'aide d'un microscope confocal automatisé.

En fin de compte, une microscopie à fluorescence automatisée suivie d'une analyse basée sur les images est utilisée pour mesurer les changements de la croissance intracellulaire de G-F-P-M-T-V. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que le dénombrement des unités formant des colonies, est qu'elle évite une longue période d'incubation et permet un débit plus élevé. La démonstration de cette procédure sera assurée par Christophe Keval ou SONG et trois chercheurs postdoctoraux de mon équipe de recherche.

Les protocoles d'analyse de bibliothèques d'ARNi et de composés utilisent des cultures de MYCOBACTERIUM tuberculosis H 37 RV exprimant la GFP âgées de deux semaines. Pour préparer la suspension bactérienne G-F-P-M-T-B, commencez par centrifuger la culture à 4 000 ×g pendant cinq minutes, jetez les surnageants, resuspendez le culot dans du DPBS, puis centrifugez de nouveau selon ce procédé. Lavez la culture trois fois avec du DPBS.

Après le troisième lavage, éliminer le surnageant et resuspendre le culot bactérien dans 10 millilitres de milieu RPMI 1640 contenant 10 % de FBS. Laisser la suspension pendant une heure à température ambiante pour permettre la sédimentation des agrégats bactériens. Récupérer le surnageant bactérien et mesurer la DO à 600 nanomètres ainsi que la fluorescence GFP.

À l'aide d'un lecteur de microplaques pour déterminer la concentration bactérienne, la DO à 600 nanomètres doit se situer entre 0,6 et 0,8. Calculez le titre de la suspension à l'aide d'une droite de régression de référence, affichant la valeur d'unités de fluorescence relative en fonction de la valeur d'unités formant colonies, établie préalablement lors d'expériences réalisées sur une autre culture préparée dans les mêmes conditions. Une concentration typique est de un fois dix puissance huit bactéries par millilitre.

Commencez cette procédure en resuspendant le lot d'ARNi séchés stocké dans des plaques mères de 96 puits avec un tampon X-S-I-R-N-A à une concentration de deux micromoles. Transférez 10 microlitres du mélange dans chaque puits d'une plaque fille de 384 puits, puis transférez 2,5 microlitres d'ARNi depuis chaque puits de la plaque fille vers une plaque d'essai de 384 puits, dans la même plaque d'essai.

Ajoutez 2,5 µL de contrôle négatif d'ARNi et de contrôle positif d'ARNi respectivement dans les puits correspondants. Si la plaque fille ne doit pas être utilisée immédiatement, scellez-la avec un film adhésif en aluminium pelable. La plaque scellée peut être conservée à moins 20 degrés Celsius pendant au moins six mois, voire jusqu'à deux à trois ans selon l'ARNi.

Suivre les recommandations du fabricant de la bibliothèque. Préparer les réactifs de transfection en les diluant dans du X-D-P-B-S afin d'obtenir une solution suffisante pour fournir 0,1 microlitre pour chaque puits. Pré-incuber la solution de transfection diluée à température ambiante pendant cinq minutes.

Ajouter 7,5 microlitres de la solution de transfection diluée dans chaque puits de la plaque d'essai 384 puits et incuber pendant 30 minutes à température ambiante avec 40 microlitres de pneumocytes humains de type deux, cellules A549, en suspension dans le milieu RPMI 1640 complété avec 10 % de sérum de veau fœtal. Maintenir les cellules pendant une période d'incubation de trois jours à 37 degrés Celsius dans une atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone. Ces cellules se divisent toutes les 24 heures, ainsi environ 12 000 cellules se trouvent dans chaque puits trois jours après la transfection.

Trois jours après la transfection par ARNsi de cellules 5 49, préparer une suspension bactérienne MTBH 37 RV GFP. Comme démontré précédemment.

La suspension doit contenir 2,4 × 10⁶ bactéries par millilitre, ce qui correspond à une multiplicité d'infection de cinq. Retirer le milieu du plateau d'essai 384 puits et ajouter 25 µL de la suspension bactérienne par puits. Incuber le plateau d'essai 384 puits à 37 °C pendant cinq heures dans une atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone.

Après cinq heures, retirez le milieu et lavez doucement les cellules trois fois avec du milieu RPMI supplémenté en 10 % de FBS afin d'éliminer les bactéries extracellulaires résiduelles. Traitez les cellules de chaque puits avec 50 microlitres.

Un milieu RPMI-FBS frais contenant 50 microgrammes par millilitre d'amikacine. Incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure dans une atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone. Enfin, retirer le milieu contenant l'amikacine et ajouter 50 microlitres de milieu RPMI frais supplémenté avec 10 % de FBS par puits.

Incuber la plaque de dosage à 37 degrés Celsius pendant cinq jours dans une atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone avant l'analyse par microscopie confocale. Pour commencer cette procédure, décongeler à température ambiante une plaque mère de 384 puits contenant la bibliothèque de composés solubilisés dans 100 % de DMSO, puis transférer 0,5 microlitre des composés de la plaque mère vers une plaque fille de 384 puits contenant 10 microlitres par puits de RPMI 1640, milieu supplémenté avec 10 % de FPS. Ensuite, récolter des macrophages humains primaires âgés de six jours à une concentration de quatre fois 10 à la puissance 5 cellules par millilitre dans du RPMI 1640.

Milieu supplémenté avec 10 % de FPS et 50 nanogrammes par millilitre de M-CSF humain recombinant. Incubez les cellules primaires diluées avec basia à différents taux de infection (MOI) allant de un à cinq, en suspension avec agitation douce à 90 tr/min pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Lavez les cellules infectées par centrifugation à 350 ×g pendant cinq minutes afin d'éliminer les bactéries extracellulaires.

Resuspendez les culots dans le milieu RPMI 1640 complété avec 10 % FPS et centrifugez. Répétez cette étape, effectuez deux lavages ; après le dernier lavage.

Ressuspendre les cellules infectées dans du milieu RPMI 1640 supplémenté avec 10 % de FBS et 50 microgrammes par millilitre. Incuber la suspension avec de l'amikacine sous agitation douce pendant une heure à 37 degrés Celsius, puis centrifuger à 350 ×g pendant cinq minutes. Éliminer le milieu contenant l'amikacine et laver les cellules infectées avec du RPMI 1640 complet.

Milieu supplémenté avec 10 % de FBS et 50 nanogrammes par millilitre de M-CSF humain recombinant. Répéter ce lavage une fois.

Ajouter 40 microlitres par puits de la suspension de macrophages infectés dans la même plaque d'essai 384 puits préparée précédemment, contenant déjà 10 microlitres des dilutions du composé. La concentration finale de DMSO dans chaque puits est désormais de 1 %. Incuber les plaques d'essai pendant cinq jours à 37 degrés Celsius dans une atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone avant l'analyse par microscopie confocale pour la bibliothèque d'ARNi. Avant l'acquisition d'images, ajouter à chaque puits de la plaque d'essai 10 microlitres de DPI fraîchement préparé à 30 microgrammes par millilitre dans du PBS et incuber pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius.

Pour le criblage de composés, avant l'acquisition d'images, colorer les cellules vivantes avec un colorant fluorescent rouge lointain perméant pour les cellules pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Charger les plaques d'essai dans un microscope confocal automatisé. Régler les paramètres d'exposition pour enregistrer la fluorescence DPI à l'aide d'un laser d'excitation à 405 nanomètres et d'un filtre d'émission à 450 nanomètres.

Enregistrez la fluorescence de la GFP en utilisant un laser d'excitation à 488 nanomètres avec un filtre d'émission à 520 nanomètres. Sélectionnez les puits et les champs à acquérir dans chaque puits, appelés respectivement des schémas et des sous-schémas. Les paramètres permettent de générer le fichier d'expérience à l'aide des paramètres définis et d'effectuer l'acquisition automatique.

Dans ce cas, quatre images différentes du même puits et du même champ sont enregistrées et transférées vers un serveur distant. Ensuite, les images sont évaluées à l'aide du logiciel d'analyse d'images acapella 2.6 pour le criblage ARNsi. Chaque champ contient deux canaux ou couleurs.

Vert pour les bactéries et bleu pour la cellule. Les noyaux détectent les noyaux cellulaires à partir du canal DAPI à l’aide d’un algorithme de détection des noyaux, et la zone bactérienne à partir du canal GFP à l’aide d’un algorithme basé sur les propriétés d’intensité des pixels. En superposant les canaux et en comptant le nombre de pixels partagés par les bactéries et les cellules, on quantifie les bactéries intracellulaires.

Les résultats finaux, exprimés comme une moyenne des quatre champs, sont la surface bactérienne totale, le nombre total de cellules, le pourcentage de cellules infectées et la surface bactérienne par cellule. Pour le criblage de composés, chaque champ contient deux canaux ou couleurs, le vert pour les bactéries et le rouge lointain pour la cellule. Les noyaux et le cytoplasme permettent de détecter la surface cellulaire à partir du canal rouge lointain et la surface bactérienne à partir du canal GFP en utilisant un algorithme basé sur les propriétés d'intensité des pixels.

En fusionnant les canaux et en comptant le nombre de pixels partagés par les bactéries et les noyaux, on quantifie les bactéries intracellulaires. Les résultats finaux, exprimés comme une moyenne des quatre champs, sont la surface bactérienne totale, la surface cellulaire totale, la surface totale des bactéries intracellulaires, ainsi que le rapport entre la surface bactérienne intracellulaire et la surface totale des cellules. Des résultats représentatifs d'un criblage génomique à haut débit par ARNsi sont présentés ici ; la suppression de l'expression de din par ARNsi a conduit à une diminution de la quantité de mycobactéries intracellulaires dans 5 49 cellules.

Comme le montrent ces images confocales représentatives de cellules 5 49 transfectées avec un ARNi non ciblé ou avec un ARNi spécifique de din un et infectées pendant cinq jours avec une souche de MTB exprimant la GFP. La souche GFP MT BH 37 RV est visualisée en vert et les cellules en rouge. Le nombre de cellules et la charge intracellulaire de G-F-P-M-T-B-H 37 RV ont été déterminés à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images.

Ce graphique montre le pourcentage de cellules A549 infectées dans cinq réplicats avec un ARNi brouillé, représentés par des cercles bleus, et un ARNi ciblant DIN1, représentés par des cercles rouges. Après trois jours de silençage et cinq jours d'infection, le pourcentage de cellules infectées est réduit de moitié dans les cellules A549 où DIN1 est silencé par rapport aux cellules transfectées avec l'ARNi brouillé non ciblant. Une normalisation basée sur l'échantillon de l'ARNi ciblant DIN1 par rapport à l'ARNi brouillé a été appliquée pour définir le score Z.

Une moyenne de Z-score aux alentours de -15 a été obtenue pour le SI ciblant le DIN1. Les trois astérisques représentent une valeur P inférieure à 0,0001. Ces résultats indiquent que le DIN1 peut être utilisé comme contrôle positif pour le SI, un écran permettant de découvrir d'autres facteurs de l'hôte impliqués dans la colonisation par le MTB et dans les pneumocytes, qui pourraient présenter un phénotype similaire à celui observé avec l'ARNi contre DIN1 lors du criblage de composés à haut débit.

L'efficacité du composé sur la croissance bactérienne intracellulaire a été évaluée en établissant une courbe de réponse dose-dépendante ou DRC, puis en normalisant par rapport aux composés de référence positifs et négatifs. Dans cet exemple, des macrophages primaires humains infectés par la souche MTBH 37 RV exprimant une GFP ont été incubés avec 1 % de DMSO en tant que contrôle négatif ou avec des concentrations croissantes de deux composés de référence, l'isid, l'INH et la rifampicine.RIF. Les macrophages sont marqués avec un colorant fluorescent rouge et la couleur verte indique la présence de MTB. L'analyse des images de fluorescence confocales des macrophages humains infectés a révélé que les composés actifs affectent la réplication intracellulaire de la MTB dans les cellules hôtes, entraînant une diminution de la charge mycobactérienne, ce qui correspond à la surface du signal GFP dans les cellules.

Le rapport entre la surface bactérienne intracellulaire et la surface totale des cellules a été calculé, puis représenté en fonction de la concentration des composés afin de générer les courbes de réponse aux doses (CRD) ; les CRD de l'isid et de la rifampicine sont présentées ici dans chaque graphique. La CRD du composé a été normalisée par rapport à celle du 1 % de DMSO, témoin négatif, et de l'isid à 0,1 microgramme par millilitre, témoin positif. Ces courbes permettent de déterminer à la fois la concentration nécessaire pour inhiber 50 % de la colonisation bactérienne et la concentration minimale requise pour inhiber 99 % de la réplication bactérienne. Un semestre.

Cette technique peut être réalisée en 10 heures réparties comme suit : deux heures pour la transfection cellulaire ou la préparation du composé, six heures pour l'infection cellulaire et la distribution dans la microplaque, et deux heures pour assurer l'acquisition d'images. Cette durée s'étend sur une période de huit jours. N'oubliez pas que le travail avec Mycobacterium tuberculosis peut être extrêmement dangereux, et que des précautions, telles que le port d'équipements de protection individuelle incluant un masque, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.