Procédé de production d’anticorps recombinants contre la métallopeptidase

Commencez avec un tube contenant un agent de transfection à base de lipides cationiques et ajoutez des plasmides d’expression recombinants.

Le plasmide porte un gène codant pour des anticorps recombinants ciblant la métallopeptidase et une protéine fluorescente verte ou GFP sous un promoteur, tandis que le gène de résistance aux antibiotiques est sous un autre promoteur.

Les lipides chargés positivement interagissent avec un plasmide chargé négativement, formant un complexe.

Transférez les complexes dans une plaque multi-puits contenant des cellules de mammifères, permettant au plasmide d’entrer dans le cytoplasme.

Le plasmide atteint le noyau et est transcrit en ARNm pour les protéines de résistance aux antibiotiques et en ARNm bicistroniques codant pour les anticorps recombinants et les GFP.

Ces ARNm conduisent à la production d’anticorps recombinants, de GFP et de protéines de résistance aux antibiotiques.

Après la transfection, remplacez le milieu par un milieu enrichi en sérum.

Introduire un antibiotique, éliminant sélectivement les cellules non transfectées pendant que les cellules transfectées résistantes aux antibiotiques survivent.

À l’aide de la technique de tri cellulaire activée par fluorescence, prélevez les cellules fluorescentes vertes exprimant des anticorps recombinants.

Ensemencez les cellules transfectées diluées dans un milieu sans sérum et incubez pour produire des anticorps recombinants contre la métallopeptidase.

Cultivez l’aminopeptidase, anticorps recombinants pET-28a(+), dans des bactéries transformées en BL21 en présence de 0,4 millimolaire de bêta-D-1-thiogalactopyranoside dans un agitateur orbital à 37 degrés Celsius pendant 10 heures. Grainez 100 microlitres 0,5 x 10⁵ cellules ovariennes de hamster chinois par puits dans une plaque de 96 puits pour une incubation à 37 degrés Celsius dans une atmosphère de dioxyde de carbone à 6 % pendant 18 à 24 heures.

Lorsque les cellules atteignent 80 % à 90 % de confluence, diluer les anticorps recombinants pIRES2-ZsGreen1 aminopeptidases dans le plasmide avec Opti-MEM à une concentration finale de 0,1 microgramme par microlitre. Après cinq minutes, mélangez les 50 microlitres d’anticorps recombinants dilués pIRES2-ZsGreen1 aminopeptidases dans le plasmide avec un microlitre de Lipofectamine 2000 et 49 microlitres d’Opti-MEM.

Après 20 minutes d’incubation, ajoutez 100 microlitres du mélange dans chaque puits d’une plaque de 96 puits contenant des cellules CHO. Quatre à six heures après la transfection, remplacer le milieu par du DMEM/F12 complété par 10 % de FBS.

Après 48 heures d’incubation, ajoutez 400 microgrammes par microlitre de G418 dans chaque puits pour sélectionner les cellules transfectées de manière stable. Après 10 jours de sélection à l’aide d’un milieu DMEM/F12 complété par 10 % de FBS et 400 microgrammes par microlitre de G418, trier les cellules avec un tri cellulaire activé par fluorescence. Diluez en série les cellules positives récoltées. Semez-les à une moyenne de 0,5 à deux cellules par puits dans une plaque de 96 puits et cultivez-les dans un incubateur à 37 degrés Celsius à 6 % de dioxyde de carbone.