Name: High Yield expression de protéines recombinantes humaines avec la transfection transitoire de cellules HEK293 en suspension (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Apprenez l'expression de glycoprotéines avec glycosylation appropriée en utilisant des cellules HEK293 en suspension. Cette méthode permet d'étudier la structure et l'activation immunitaire des anticorps.

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Ce travail a été soutenu financièrement par les subventions K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) et P01GM107012 (KWM) des Instituts nationaux de la santé, et par des fonds provenant du Roy J. Carver Département de biochimie, biophysique et biologie moléculaire à l&#39;Université de l&#39;Iowa . Le contenu de ce travail est de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de la NIH.

Tous les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent dans ce manuscrit.

Ce protocole illustre l&#39;expression de la protéine par l&#39;intermédiaire de la transfection transitoire de cellules HEK293F ou S. Les conditions de transfection optimales établies dans les laboratoires et Barb Moremen emploient une combinaison critique de concentrations de densité de cellules et de réactifs pour réaliser la transfection à haut rendement. Considérations critiques lors de la mise en œuvre de ce protocole comprennent: le maintien d&#39;une culture stable avant la transfection (avec la culture cohérent...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/53568">High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension</a>. The Authors section was updated. from:
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia
to
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam W. Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

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Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Produire des rendements élevés de protéines humaines pliées de manière appropriée et modifications post-traductionnelles pour l&#39;analyse détaillée de la structure et de la fonction demeure un défi important. Un grand nombre de systèmes d&#39;expression sont disponibles qui produisent des protéines recombinantes avec fonction native-like et le comportement. Systèmes d&#39;expression bactériens, principalement des souches d&#39;Escherichia coli, représentent les outils les plus accessibles et couramment utilisés dans le domaine de la recherche, en raison de la simplicité de ces systèmes d&#39;expression, bien que la levure, des plantes, les insectes et les mammifères sont également décrits 1-4. Cependant, la plupart de ces systèmes sont incapables de modification post-traductionnelle appropriée des protéines cibles. Un intérêt fondamental des laboratoires Barb et Moremen est la production de protéines eucaryotes avec une glycosylation appropriée. Beaucoup de protéines humaines exigent glycosylation appropriée pour le bon fonctionnement (voir 5). Le eucaryotemachines de glycosylation est vaste et capable de faire un large éventail de modifications, incluant à la fois l&#39;asparagine (N) - et de la sérine / thréonine (O) lié en glycanes complexes 6. On estime que&gt; 50% des protéines humaines sont N-glycosylées 7. Glycanes sont des composantes essentielles de nombreuses protéines, y compris des anticorps thérapeutiques monoclonaux, l&#39;érythropoïétine, et les facteurs de coagulation du sang comme le facteur IX, pour ne nommer que quelques-uns. Bien que plusieurs méthodes existent pour préparer des protéines convenablement N-glycosylée et vont de purement synthétique 8-10, 11-14 à chimioenzymatiques ou la récupération de systèmes recombinants d&#39;ingénierie 15-20, sans surprise, des systèmes d&#39;expression humains ont jusqu&#39;ici avéré être le plus robuste des procédés pour générer des protéines humaines. De nombreuses glycoprotéines humaines thérapeutiques sont produits dans des systèmes recombinants en utilisant des cellules de mammifères. Systèmes de la note sont l&#39;ovaire de hamster chinois (CHO), myélome de souris (NS0), Baby Hamster Kidney (BHK), de rein embryonnaire humain (HEK-293) et des lignées de cellules rétiniennes humaines qui sont utilisés dans l&#39;adhésion ou de la suspension de culture pour la production de protéine 4,21,22. Cependant, les systèmes d&#39;expression de protéines de mammifère ont nécessité la production de lignées cellulaires stables, des milieux de croissance et le substrat coûteuses procédures de transfection assistée 23. La transfection de cellules de mammifère est obtenue à l&#39;aide de nombreux agents, y compris les phosphates de calcium, les polymères cationiques 24,25 (DEAE-dextrane, le polybrène, la polylysine, polyéthylimine (PEI)) ou des liposomes cationiques chargés positivement 26-29. PEI est un polycationique, chargé, linéaire ou ramifié en polymère (25 kDa) 26 qui forme un complexe stable avec l&#39;ADN et est endocytose. Lors de l&#39;acidification de l&#39;endosome, PEI est pensé pour gonfler, ce qui conduit à la rupture des endosomes et la libération de l&#39;ADN dans le cytoplasme de 26,30. Jusqu&#39;à récemment, la transfection transitoire dans suspensila culture a été réalisée par la formation du complexe ADN / PEI avant suivie de l&#39;addition à la culture de cellules 29. Cependant, Würm et ses collaborateurs ont rapporté un protocole est performant optimisé pour une production de protéines recombinantes dans des cellules HEK293 qui ont formé un complexe ADN / PEI in situ 31,32. Ceci évite préparation, la stérilisation du complexe, et l&#39;échange de tampon dans un milieu de culture. Poursuite de l&#39;optimisation en incluant des plasmides d&#39;expression amélioration conduit à une augmentation significative de rendement 33. Est ici une méthode qui se fonde sur ces avancées et est largement applicable. Conditions d&#39;expression peuvent aussi être modifiées pour influer sur la composition de N-glycanes. La lignée cellulaire HEK293S, avec une deletion de gène qui interrompt le traitement de N-glycane à un stade intermédiaire, conduit à l&#39;expression de protéines avec des uniformes N-glycanes comprenant 2 résidus N-acétylglucosamine et cinq résidus de mannose (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Ces cellulespas la N-acétylglucosaminyl transférase I (GntI) gène qui est nécessaire pour la N-glycane en aval traitement 36,37. L&#39;utilisation d&#39;inhibiteurs de glycosyltransférase comprenant kifunensine, des analogues d&#39;acide sialique et l&#39;analogue de fucose et de 2-désoxy-2-fluoro-fucose a des effets de traitement et les limites de N-glycane 38-41 similaires. Le protocole indiqué ici utilise le vecteur pGEN2 comme représenté sur la figure 1 42,43, PEI transfection transitoire dans des cellules assistée lignes de mammifères ou des cellules HEK293F (HEK293S), et la récupération des rendements élevés de protéine glycosylée de façon appropriée. Ce système est robuste et peut accueillir divers facteurs, notamment marquage isotopique et de l&#39;ingénierie glycane pour la production de grandes titres de protéines recombinantes.

<table><tbody><tr><td>Enceinte de biosécurité&nbsp ;</td><td>NuAire, Inc.</td><td>CellGard ES NU-S475-400</td><td>Classe II, Type A2 Armoire de sécurité biologique</td></tr><tr><td>Agitateur d’incubation</td><td>INFORS HT</td><td></td><td>Multitron Cell&nbsp ;</td></tr><tr><td>Medium A : Medium d’expression FreeStyle&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td></td></tr><tr><td>Medium B : ExCell 293 Sans Sérum&nbsp ;</td><td>SIGMA</td><td>14571C&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>125 Erlenmeyer avec capuchon ventilé</td><td>Corning Incorporated/Life Sciences</td><td>431143</td><td></td></tr><tr><td>250 Erlenmeyer avec capuchon ventilé</td><td>Corning Incorporated/Life Sciences</td><td>431144</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle HEK 293F Cells</td><td>Life Technologies</td><td>R790-07</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Pipette sérologique jetable</td><td>Fisher Scietific</td><td>13-676-10B</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipette sérologique jetable</td><td>Fisher Scietific</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Pipette sérologique jetable</td><td>Fisher Scietific</td><td>13-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>Pipette (Pipet-Aid XP)</td><td>Drummond Scientific</td><td>161263</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific&nbsp ;</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td>Comptage des diapositives&nbsp ;</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Compteur de cellules automatisé</td><td>Bio-Rad&nbsp ;</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylénimine (Î.-P.-É)</td><td>Polysciences Inc.</td><td>23966</td><td>Préparer une solution mère à une concentration de 1 mg/ml dans un tampon contenant 25 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinethanesulfonique (HEPES) et 150 mM de NaCl (pH 7,5). Dissoudre complètement l’Île-du-Prince-Édouard ; Stériliser par 0,22 &mu ; M seringue filtrer et stocker à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES)</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue de 25 mm, 0,22 &mu ; M</td><td>Fisher Scietific</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>Trisaminométhane (base Tris)</td><td>Fisher Scietific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue</td><td>Stratagene</td><td>222249</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Fisher Scietific</td><td>BP1421-2</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Fluka Analytical&nbsp ;</td><td>92144</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Produits chimiques BDH</td><td>BDH8014</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purification de plasmides</td><td>QIAGEN</td><td>12145</td><td></td></tr><tr><td>Valproic (VPA)</td><td>SIGMA</td><td>P4543</td><td>Préparer une solution mère de 220 mM dans l’eau, stériliser par passage à travers un filtre stérile de 0,22 mm et conserver à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Thermo Scientific&nbsp ;</td><td>EW-17707-65</td><td></td></tr><tr><td>Protéine A-Colonne de sépharose</td><td>SIGMA</td><td>P9424</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow</td><td>QIAGEN</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>Acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique (MOPS)</td><td>Fisher Scietific</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scietific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>10 kDa seuil de coupure de poids moléculaire Amicon&reg ; Filtres ultra centrifuges&nbsp ;</td><td>Millipore</td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium</td><td>ALDRICH</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Bêta-mercaptoéthanol</td><td>ALDRICH</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>SIGMA</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein All Blue Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0373</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique, glacial&nbsp ;</td><td>Fisher Scietific</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>coomassie bleu brillant&nbsp ;</td><td>Bio-Rad&nbsp ;</td><td>161-0406</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO&nbsp ;</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15N marqué L-Tyrosine</td><td>ALDRICH</td><td>332151</td><td></td></tr><tr><td>15N marqué L-Lysine</td><td>ALDRICH</td><td>592900</td><td></td></tr><tr><td>Non marqué L-Phénylalanine</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>13C6-Glucose</td><td>ALDRICH</td><td>389374</td><td></td></tr><tr><td>2- désoxy-2-fluoro-l-fucose&nbsp ;</td><td>SANTA CRUZ Biotechnologie</td><td>sc-283123</td><td></td></tr></tbody></table>

high yield expression de protéines recombinantes humaines avec la transfection transitoire de cellules hek293 en suspension

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

L&#39;art de la production de protéines recombinantes avec des modifications post-traductionnelles complexes représente un défi majeur pour les études de structure et la fonction. La mise en place rapide et de récupération élevés de lignées cellulaires de mammifères transitoirement transfectées aborde cette barrière et est un moyen efficace d&#39;exprimer des protéines qui sont naturellement acheminée par le ER et Golgi voie de sécrétion médiée. Voici un protocole pour l&#39;expression de protéine en utilisant la HEK293F humain et des lignées de cellules transfectées HEK293S avec un vecteur d&#39;expression de mammifère destiné à des rendements élevés de protéines. L&#39;applicabilité de ce système est démontrée en utilisant trois glycoprotéines représentatives qui ont exprimé avec des rendements entre 95-120 mg de protéine purifiée récupérée par litre de culture. Ces protéines sont le FcyRIIIa humain et la sialyltransférase α2-6 de rat, ST6GalI, tous deux exprimés avec une fusion GFP N-terminale, ainsi que l&#39;immunoglobuline humaine non modifiée G1 Fc. Cette robustes uti systèmeLizes un milieu exempt de sérum qui peut être adapté pour l&#39;expression de protéines et d&#39;hydrates de carbone pour des études structurales par spectrométrie de masse et spectroscopie de résonance magnétique nucléaire isotopiquement enrichis. En outre, la composition du N-glycane peut être réglée par addition d&#39;une petite molécule pour empêcher certaines modifications glycanniques d&#39;une manière qui ne réduit pas le rendement.

Expression de la protéine de haut niveau et de la pureté Ce système d&#39;expression optimisé généré un rendement élevé de protéines glycosylées. Un motif typique est montrée dans l&#39;expression de Fc-IgG1 (figure 1). Dans ce cas, jour 0 est le jour de la transfection suivie par Jour 1 (dilution) et les jours de culture subséquentes jusqu&#39;à Jour 5. expression de la protéine est analysée en utilisant la f...

La production à l’échelle du laboratoire de protéines eucaryotes avec une modification post-traductionnelle appropriée représente un obstacle important. Voici un protocole robuste avec une mise en place et un délai d’exécution rapides pour l’expression de protéines à l’aide d’un système d’expression de mammifères. Ce système prend en charge le marquage sélectif des acides aminés, le marquage sélectif des protéines et les modulateurs de petites molécules de la composition des glycanes.

High Yield expression de protéines recombinantes humaines avec la transfection transitoire de cellules HEK293 en suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

L'objectif général de cette procédure est d'exprimer des glycoprotéines de mammifères avec une glycosylation adaptée en ciblant les protéines recombinantes vers le réticulum endoplasmique et la voie sécrétoire médiée par le GOGI. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en immunologie, comme quel est le rôle d'une spécificité, des motifs dans la structure et le potentiel d'activation immunitaire des anticorps et des fragments d'anticorps. Le principal avantage de cette technique est qu'elle utilise des cellules humaines pour exprimer des protéines humaines, ce qui fournit le contexte cellulaire adéquat pour replier correctement les protéines cibles et les modifier de façon appropriée.L’agitateurbain pour l’établissement des cellules doit fonctionner à 135 tr/min, 80 % d’humidité, 8 % de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius, au moins une heure avant l’inoculation de la culture. Allumez la lampe à rayons ultraviolets de la cabine de sécurité biologique, préchauffez les flacons scellés de milieu A et de milieu B dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Éteignez les lumières ultraviolettes et stérilisez la cabine de sécurité biologique à l’aide d’une solution d’eau et d’éthanol à 70 %.Stérilisez un flacon de culture Erlenmeyer de 125 millilitres avec un bouchon ventilé, des pipettes, des pipeteurs et des flacons de milieu préchauffés en les pulvérisant avec une solution d'éthanol à 70 % dans l'eau. Placez ces éléments dans la hotte de sécurité biologique tout au long de cette procédure. Tous les éléments doivent être stérilisés de cette manière avant d'être introduits dans la hotte de sécurité biologique.Préparer un milieu de culture frais pour une culture de 30 millilitres en prélevant 26 millilitres du milieu A et trois millilitres du milieu B, puis transférer le tout dans un flacon Erlenmeyer de 125 millilitres. Mélanger par agitation douce. Réchauffer dans un bain-marie à 37 degrés Celsius une fiole de cellules HEK 293 F précédemment congelées à moins 80 degrés Celsius jusqu'à ce que les cellules commencent à dégeler. Cette étape prend environ une minute et les cellules ne doivent pas être complètement dégelées.Ensuite, stérilisez l'extérieur du flacon à l'aide de la solution d'éthanol à 70 % dans l'eau et placez-le dans la hotte de sécurité biologique. À l’aide d’une pipette de un millilitre, prélève la suspension cellulaire et transférez-la dans le flacon Erlenmeyer de 125 millilitres contenant 29 millilitres de milieu de culture frais. Fermez le couvercle du flacon de culture et placez le flacon dans l’agitateurs incubateur pendant 24 heures.24 heures après l'inoculation de la culture. Vérifiez la densité cellulaire, stérilisez le flacon de culture avec une solution d'éthanol à 70 % et d'eau, puis placez-le dans la hotte de sécurité. À l'aide d'une pipette de un millilitre et d'un pipeteur, prélève lentement 100 microlitres de la culture et transfère-les dans un tube einor stérile de 0,5 millilitre.Fermer le couvercle du flacon de culture et replacer le flacon de culture dans l'incubateur agitateur le plus rapidement possible. Mélanger 7,5 microlitres d'une solution de bleu de trypan avec 7,5 microlitres de cellules. Agiter vigoureusement, puis transférer 7,5 microlitres du mélange sur une lame de comptage.Activez le compteur automatique de cellules et insérez la lame de comptage dans la chambre de chargement. Le lecteur automatique se met en marche et compte les cellules automatiquement en unités de nombre de cellules par millilitre et en pourcentage de viabilité. Déterminez le volume de la culture donneur nécessaire à transférer dans un milieu de culture frais afin d'obtenir une densité cellulaire de 300 000 cellules vivantes par millilitre.Préparer un milieu de culture frais comme indiqué précédemment en transférant 23 millilitres du milieu A et 3 millilitres du milieu B dans un flacon de culture neuf de 125 millilitres. Ensuite, retirer les flacons stock de milieu A et de milieu B du coffret de sécurité biologique afin de réduire le risque de contamination. Récupérer le flacon de culture de cellules HEK 293 F depuis l’incubateur.Pulvérisez-le avec la solution d'éthanol à 70 % et d'eau, puis placez-le dans l'enceinte de sécurité biologique à l'aide d'une nouvelle pipette. Prélevez l'aliquote correct de cellules à partir de la culture et transférez-le dans le flacon contenant le milieu de culture frais. Transférez les deux cultures de l'enceinte de sécurité biologique vers l'agitateurs incubateur.Faire croître les cellules jusqu'à une densité d'environ deux à trois millions de cellules vivantes par millilitre avant la transfection. Vérifier la densité cellulaire comme indiqué précédemment et déterminer la quantité de cellules nécessaire pour la transfection. À l'aide d'une pipette sérologique stérile.Transférez le volume approprié de suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 250 millilitres. Récupérez les cellules par centrifugation à 100 ×g pendant cinq minutes. Après stérilisation, transférez le tube contenant le culot cellulaire dans l'enceinte de sécurité biologique.Utilisez une pipette stérile pour décantation du surnageant composé de milieu de culture usé. Resuspendre vigoureusement les cellules en culot par pipetage ascendant et descendant à l’aide de 10 millilitres de milieu de culture frais, puis transférer dans un flacon préparé contenant du milieu de culture frais pour la transfection. Visser le bouchon sur le flacon de culture cellulaire ventilé et incuber le flacon dans l’incubateur agitateur pendant 15 minutes à une heure, pendant que les cellules sont en incubation.Diluez l'ADN plasmatique et les stocks de POLYETHERAMINE ou de PEI à l'aide de milieu de culture frais pour obtenir une concentration finale de 0,5 microgramme par microlitre. Retirez le flacon de culture contenant les cellules dispersées de l'agitateurs incubateur et transportez-le dans la cabine de sécurité biologique. À l’aide d’une micropipette, ajoutez 300 microlitres d’ADN plasmatique à la culture et mélangez par agitation manuelle douce, puis ajoutez 900 microlitres de PEI à la culture et mélangez à nouveau. Ensuite, ajoutez 3,8 millilitres de milieu de culture frais.Transférez le flacon dans l’agitateurbain thermostaté pendant 24 heures. Vingt-quatre heures après la transfection, le milieu de culture cellulaire doit être dilué. Pour préparer le milieu de dilution, commencez par utiliser une pipette serologique stérile de un millilitre afin de prélever un millilitre d’acide valproïque PREWARM à 220 millimolaire ou VPA, puis transférez-le dans un tube stérile de 50 millilitres.Ensuite, utilisez une pipette stérile de type serologique pour ajouter cinq millilitres de milieu B préchauffé et 44 millilitres de milieu A préchauffé à la solution de VPA. Cela donne 50 millilitres de milieu de culture frais avec une concentration finale de 4,4 millimolaire de VPA. Récupérez la culture transfectée à partir de l'incubateur.Stérilisez l'extérieur du flacon et placez le flacon dans la hotte de sécurité biologique. Ajoutez le milieu de dilution préparé à la culture. Replacez le flacon dans l'agitateurncubateur pendant quatre à cinq jours supplémentaires après la transfection.Surveiller quotidiennement la viabilité cellulaire selon la procédure démontrée précédemment. Des aliquotes doivent également être conservées chaque jour pour l'analyse de l'expression protéique, cinq à six jours après la transfection ou si la viabilité cellulaire tombe en dessous de 50 %. Récolter les cellules par centrifugation des cellules et du milieu à 1000 × g pendant cinq minutes. Recueillir le surnageant qui contiendra la protéine sécrétée, puis ajouter cinq millilitres d'une solution de javel à 10 % au culot de cellules HEK et éliminer le tout comme déchet biologique.Ensuite, la protéine est purifiée à partir du surnageant recueilli. Ce système d'expression a produit un rendement élevé de protéines glycosylées, comme le montre ce profil d'expression typique de la partie Fc d'IgG1 après transfection transitoire de cellules HEK 293F. La purification par affinité à l'aide d'une colonne de protéine pour la Fc d'IgG1 ou d'une colonne au nickel pour la GFP marquée par un tag histidine avec le récepteur Fc gamma trois A a permis d'obtenir des protéines de haute pureté.Ce système a permis d'exprimer efficacement l'IgG1 FC enrichie isotopiquement dans ce spectre de RMN bidimensionnel qui corréle la fréquence de résonance des noyaux d'hydrogène et de l'azote amide directement lié. Des signaux bien dispersés des atomes 15N ont été observés. Différentes formes glycosylées ont été produites avec des cellules HEK 293F et HEK 293S dans différentes conditions de culture, comme le montrent les analyses par spectrométrie de masse avec ionisation par désorption laser assistée par matrice.IgG un FC exprimé à partir de cellules HEK 293, portait des glycanes de forme comprenant cinq mannoses plus deux résidus de N-acétylglucosamine, tandis que les glycanes sans fucose provenant du matériau exprimé par des cellules HEK 293F présentaient des formes complexes biantennaires avec fucose du noyau et possédaient majoritairement des extrémités en N-acétylglucosamine ou, dans une faible proportion, des formes mono- ou di-sialylées. L'ajout d'un inhibiteur de la glycosylation lors d'une expression réalisée à l'aide de cellules HEK 293F a montré une réduction de plus de 90 % de l'incorporation de fucose. Une fois maîtrisée, la mise en place de la transfection transitoire peut être réalisée en 1,5 heure le jour un et en 15 minutes le jour deux. Après une période d'expression de quatre à six jours, la solution contenant la protéine peut être récoltée en 15 minutes.Enfin, la purification de la protéine prendra environ 1,5 heure. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir une culture stable avant la transfection, de transfecter des cellules en pleine croissance et d'ajouter l'ADN avant d'ajouter le PEI. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que la caractérisation fonctionnelle des protéines à l'aide d'une gamme de techniques biophysiques, peuvent être réalisées afin d'étudier la structure et la fonction de la glycoprotéine exprimée après son obtention.Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'immunologie pour explorer la relation structure-activité de l'IgG et de la glycosylation in vitro et in vivo. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de préparer et de purifier les glycoprotéines en utilisant notre combinaison de cellules K 2 93 F et du vecteur PZ N deux.

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