High Yield expression de protéines recombinantes humaines avec la transfection transitoire de cellules HEK293 en suspension

La production à l’échelle du laboratoire de protéines eucaryotes avec une modification post-traductionnelle appropriée représente un obstacle important. Voici un protocole robuste avec une mise en place et un délai d’exécution rapides pour l’expression de protéines à l’aide d’un système d’expression de mammifères. Ce système prend en charge le marquage sélectif des acides aminés, le marquage sélectif des protéines et les modulateurs de petites molécules de la composition des glycanes.

L’objectif global de cette procédure est d’exprimer des glycoprotéines de mammifères avec une glycosylation appropriée chez les mammifères en ciblant les protéines recombinantes sur la voie sécrétoire médiée par le RE et le GOGI. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en immunologie telles que le rôle d’une spécification, les modèles dans la structure et le potentiel d’activation immunitaire des anticorps et des fragments d’anticorps. Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise des cellules humaines pour exprimer des protéines humaines, ce qui fournit le missionnaire cellulaire approprié pour plier et modifier correctement les protéines cibles.

L’agitateur d’incubation pour l’établissement de la cellule doit fonctionner à 135 tr/min, 80 % d’humidité, 8 % de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius au moins une heure avant l’inoculation de la culture. Allumez la lampe UV de l’enceinte de biosécurité, préchauffez les bouteilles scellées du milieu A et du milieu B dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Éteignez les lampes UV et stérilisez l’enceinte de biosécurité avec une solution à 70 % d’éthanol et d’eau.

Stérilisez un erlenmeyer de croissance de 125 millilitres avec des pipettes à capuchon ventilé, des pipettes et des flacons de milieu préchauffé en pulvérisant une solution d’éthanol à 70 % dans de l’eau. Placez ces articles dans l’enceinte de biosécurité tout au long de cette procédure. Tous les articles doivent être stérilisés de cette manière avant d’être introduits dans l’enceinte de biosécurité.

Préparez un milieu de culture frais pour une culture de 30 millilitres en prélevant 26 millilitres de milieu A et trois millilitres de milieu B et en les transférant dans l’erlenmeyer de 125 millilitres. Mélangez en secouant doucement, tiède, un flacon de cellules HEK 2 93 F préalablement congelé à moins 80 degrés Celsius dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pour décongeler partiellement les cellules. Cela prend environ une minute et les cellules ne doivent pas être complètement décongelées.

Ensuite, stérilisez l’extérieur du flacon avec la solution d’éthanol à 70 % dans l’eau et déplacez-le dans l’enceinte de biosécurité. À l’aide d’une pipette d’un millilitre, prélever la suspension cellulaire et la transférer dans l’erlenmeyer de 125 millilitres contenant 29 millilitres de milieu de culture frais. Fermez le couvercle du ballon de culture et placez le ballon dans l’agitateur de l’incubateur pendant 24 heures.

24 heures après l’inoculation de la culture. Vérifiez la densité cellulaire, stérilisez le ballon de culture avec la solution d’éthanol à 70 % et d’eau et déplacez-le dans l’enceinte de biosécurité. À l’aide d’une pipette d’un millilitre et d’un pipeteur, prélevez lentement 100 microlitres de la culture et transférez-la dans un tube stérile de 0,5 millilitre.

Fermez le couvercle du ballon de culture et remettez-le dans l’agitateur de l’incubateur dès que possible. Mélangez 7,5 microlitres d’une solution trian blue avec 7,5 microlitres de cellules. Mélangez vigoureusement, puis transférez 7,5 microlitres du mélange sur une lame de comptage.

Allumez le compteur automatique de cellules et placez la glissière de comptage dans la chambre de chargement. Le lecteur automatique est activé et les cellules sont comptées automatiquement en unités de nombre de cellules par millilitre et de pourcentage de viabilité. Déterminer le volume de la culture du donneur nécessaire au transfert dans un milieu de culture frais afin d’obtenir une densité cellulaire de 300 000 cellules vivantes par millilitre.

Préparez le milieu de culture frais comme indiqué précédemment en transférant 23 millilitres de milieu A et trois millilitres de milieu B dans une fiole de culture fraîche de 125 millilitres. Après cela, retirez les bouteilles de stock du milieu A et du milieu B de l’enceinte de biosécurité pour réduire le risque de contamination. Récupérez la fiole de culture cellulaire HEK 2 93 F de l’incubateur.

Vaporisez-le avec la solution d’éthanol à 70 % et d’eau et placez-le dans l’enceinte de biosécurité à l’aide d’une pipette neuve. Prélever l’aliquote correcte des cellules de la culture et la transférer dans le ballon contenant la culture fraîche. Douleur moyenne. Transférez les deux cultures de l’enceinte de biosécurité à l’agitateur de l’incubateur.

Cultivez les cellules à une densité approximative de deux à 3 millions de cellules vivantes par millilitre avant la transfection. Vérifiez la densité cellulaire comme démontré précédemment et déterminez la quantité de cellules pour la transfection. À l’aide d’une pipette sérologique stérile.

Transférez le volume approprié de suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 250 millilitres. Prélever les cellules par centrifugation à 100 fois G pendant cinq minutes. Après la stérilisation, transférez le tube contenant les cellules granulées dans l’enceinte de biosécurité.

À l’aide d’une pipette stérile, décanter le surnageant constitué de produits usés. Le milieu de culture renvoie vigoureusement les cellules granulées en pipetant de haut en bas à l’aide de 10 millilitres de milieu de culture frais, puis transfère dans un flacon préparé contenant une culture de transfection fraîche. Douleur moyenne. Vissez le capuchon sur le flacon de culture cellulaire ventilé et incubez le ballon dans l’agitateur de l’incubateur pendant 15 minutes à une heure pendant l’incubation des cellules.

Diluer l’ADN plasmatique et les stocks de POLYÉTHERAMINE ou de PEI à l’aide d’un milieu de culture frais jusqu’à une concentration finale de 0,5 microgramme par microlitre. Retirer le flacon de culture contenant les cellules dispersées de l’agitateur de l’incubateur et l’amener dans l’enceinte de biosécurité à l’aide d’une micropipette et de 300 microlitres d’ADN plasmatique jusqu’à la culture et mélanger en agitant doucement manuellement à 900 microlitres de PEI dans la culture et mélanger à nouveau. Puis à 3,8 millilitres de milieu de culture frais.

Transférez le ballon dans l’agitateur de l’incubateur pendant 24 heures. 24 heures après la transfection, la culture cellulaire doit être diluée. Pour préparer d’abord le milieu de dilution, utilisez une pipette sérologique stérile d’un millilitre pour prélever un millilitre d’acide valproïque ou VPA PREWARM 220 millimolaires et le transférer dans un tube stérile de 50 millilitres.

Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique stérile, ajoutez cinq millilitres de milieu préchaud B et 44 millilitres de milieu préchaud A à la solution de VPA. Il en résulte 50 millilitres de milieu de culture frais avec une concentration finale de 4,4 millimolaires de VPA. Récupérez la culture transfectée de l’incubateur.

Stérilisez l’extérieur du ballon et placez-le dans l’enceinte de sécurité biologique. Ajouter le milieu de dilution préparé à la culture. Transférez le ballon dans l’agitateur de l’incubateur pendant quatre à cinq jours supplémentaires après la transfection.

Surveiller quotidiennement la viabilité cellulaire par la procédure démontrée précédemment. Des aliquotes doivent également être conservées chaque jour pour l’analyse de l’expression des protéines, cinq à six jours après la transfection ou si la viabilité cellulaire tombe en dessous de 50 %. Récoltez les cellules en centrifugeant les cellules et le milieu à 1000 fois G pendant cinq minutes. Prélever le surnageant qui contiendra la protéine sécrétée à raison de cinq millilitres d’une solution d’eau de Javel à 10 % dans la pastille de cellules HEK et le jeter comme risque biologique.

Par la suite, les protéines sont purifiées à partir du surnageant collecté. Ce système d’expression a généré un rendement élevé de protéines glycosylées illustré par ce modèle d’expression typique des IgG un fc après transfection transitoire des cellules HK 2 93 F. La purification d’affinité à l’aide d’une colonne protéique pour les IgG 1 FC ou d’une colonne de nickel pour l’histamine marquée GFP avec le récepteur gamma FC trois A a permis d’obtenir des protéines de haute pureté.

Ce système a exprimé efficacement les IgG un FC enrichis en isotopie dans ce spectre RMN bidimensionnel qui corrèle la fréquence de résonance des noyaux d’hydrogène et l’azote amide directement lié. 15 atomes de signaux bien dispersés ont été observés. Différentes formes de glyco ont été produites avec des cellules HEK 2 93 F et HEK 2 93 s dans différentes conditions de culture, comme le montrent les analyses par spectrométrie de masse par DESORPTION laser assistée par matrice.

Les IgG un FC exprimés à partir de cellules HEK 2 93 s, hébergées et les glycanes qui étaient d’une forme avec cinq anos plus deux résidus de glucosamine N acétyle qui ne contenaient pas de glucose FU de HEK 2 93 F express étaient des formes d’itinéraire de type bi complexes avec du glucose FU de base et ayant principalement de la N acétyl glucosamine terminale ou une petite proportion de formes mono ou dilatées. L’ajout d’un inhibiteur de glycanation à une expression réalisée à l’aide de cellules HEK 2 93 F a montré une réduction supérieure à 90 % de l’incorporation de fuco Une fois maîtrisée, l’établissement de la transfection transitoire peut être réalisé en 1,5 heure le premier jour et en 15 minutes le deuxième jour. Après une période d’expression de quatre à six jours, la solution contenant la protéine peut être récoltée en 15 minutes.

Enfin, la purification de la protéine prendra environ 1,5 heure lors de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir une culture stable avant la transfection transfect cellules en croissance active et d’ajouter de l’ADN avant d’ajouter du PEI. En suivant cette procédure. D’autres méthodes, comme la caractérisation fonctionnelle des protéines à l’aide d’une gamme de techniques biophysiques, peuvent être réalisées afin de sonder la structure et la fonction de la glycoprotéine exprimée après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunologie pour explorer la relation structure-activité des IgG et de la glycosylation in vitro et in vivo. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation et de la purification des glycoprotéines à l’aide de notre combinaison d’une cellule K 2 93 F et du vecteur PZ N deux.