Analyse basée sur la cytométrie en flux de l’activation des cellules dendritiques à l’aide de complexes immunitaires

Commencez par une suspension de cellules tumorales chimiquement fixée.

Ajoutez une concentration optimale d’immunoglobuline G liant la tumeur qui se lie aux antigènes de surface des cellules tumorales, formant des complexes immuns ou CI.

Transférez les CI dans une plaque de culture contenant des cellules dendritiques collées. Couver.

La cellule dendritique reconnaît le CI, l’internalise et le traite en fragments peptidiques.

Les fragments sont chargés sur des molécules du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II ou CMH-II et présentés à la surface de la cellule, avec la molécule de costimulation CD86.

Retirez le support. Ajoutez un tampon de dissociation cellulaire et pipetez vigoureusement pour détacher les cellules.

Transférez les cellules dans un tube.

Centrifugez et mettez en suspension les cellules dans une solution bloquante pour bloquer les interactions non spécifiques.

Superposition avec un cocktail d’anticorps marqués au fluorophore ciblant le CMH-II et le CD86.

Ajoutez un colorant de liaison à l’ADN et incubez brièvement pour colorer les noyaux de cellules mortes.

À l’aide de la cytométrie en flux, identifiez les cellules vivantes co-exprimant le CMH-II et le CD86, confirmant ainsi l’activation des cellules dendritiques médiée par l’IC.

Tout d’abord, fixez les cellules dans du paraformaldéhyde tamponné à 1,8 % pendant 10 minutes à température ambiante. Ensemencez la suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque en forme de U à 96 puits. Ensuite, ajoutez des dilutions variables d’anticorps de liaison tumorale dans chaque puits. Par la suite, incubez les cellules sur de la glace pendant 15 à 20 minutes.

Après l’incubation, laver les cellules avec 150 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate, puis centrifuger à 400 fois g pendant 5 à 10 minutes à 4 degrés Celsius. Après la centrifugation, expulsez le surnageant et lavez les cellules deux fois. Dissoudre les cellules dans 100 microlitres de tampon FACS, contenant des anticorps secondaires conjugués aux fluorophores. Ensuite, incubez l’assiette sur de la glace pendant 15 à 20 minutes.

Après 15 à 20 minutes, ajoutez 200 microlitres de tampon FACS pour laver les cellules. Centrifugez la plaque à 400 fois g pendant 5 à 10 minutes. Décanter le surnageant. Effectuez une cytométrie en flux pour analyser la liaison tumorale et déterminer la concentration minimale d’immunoglobuline G nécessaire pour enrober les cellules.

Une fois que les cellules sont recouvertes d’une concentration minimale d’immunoglobuline G, ajoutez le complexe immunitaire tumoral marqué CFSE aux cellules dendritiques dérivées des monocytes dans un rapport de 1:5. Ensuite, incubez le mélange pendant 12 à 16 heures toute la nuit dans un milieu complet. Effectuer une analyse FACS de l’activation des cellules dendritiques dérivées de monocytes.