Stimulation in vitro et visualisation de la libération de piège extracellulaire dans les macrophages humains différenciés dérivés de monocytes

La libération de pièges extracellulaires par les neutrophiles et autres cellules immunitaires est importante dans l’immunité innée mais aussi fortement liée aux pathologies inflammatoires. Très peu est connu au sujet de ce processus dans les macrophages bien que ces cellules jouent un rôle critique dans la réponse inflammatoire. Ce protocole fournit un modèle in vitro humain primaire de piège extracellulaire de macrophages ou de libération de mât.

Il fournit un modèle pour nous d’étudier une croissance physiologique potentielle de cette structure in vivo. Le principal avantage de cette technique est que les cellules de ce protocole sont des cellules primaires isolées des préparations de couches buffy humaines. Il n’y a pas d’étape d’amorçage nécessaire pour différencier le monocyte en macrophages, ce qui contraste avec d’autres lignées cellulaires monocytes telles que la lignée cellulaire THP-1.

Ce protocole est facilement adapté à d’autres cellules immunitaires, y compris le neutrophile isolé et les microglies. Les pièges extracellulaires produits par les macrophages sont très fragiles, il faut donc prendre soin de préserver l’intégrité des pièges tachés. Dans des conditions stériles, préparer le milieu d’amorçage M1 en ajoutant au milieu de culture complet du RPMI-1640, l’interféron gamma à la concentration de 20 nanogrammes par millilitre et le lipopolysaccharide à la concentration d’un microgramme par millilitre.

Préparez les supports d’amorçage M2 en ajoutant l’interleukine 4 à l’ensemble des médias de culture RPMI-1640 à la concentration de 20 nanogrammes par millilitre. Dans des conditions stériles, aspirer les médias des puits de plaques de culture tissulaire ensemencées et cultivés contenant du HMDM. Ajouter délicatement dans chaque puits, un millilitre de PBS stérile préchauffé à 37 degrés Celsius.

Retirez le tampon PBS et lavez-le deux fois de plus. Ajouter un millilitre de supports d’amorçage M1 ou M2 à chaque puits contenant le HMDM. Incuber les cellules pendant 48 heures à 37 degrés Celsius en présence de 5% de dioxyde de carbone dans un incubateur cellulaire.

Dans des conditions stériles, préparez les médias culturels contenant différents stimulateurs de la libération du MET à l’ensemble des médias RPMI-1640. Pour des expériences avec la stimulation acide hypochlorous, préparez l’acide hypochlorous de 200 micromolaires dans un tube de Faucon avec HBSS qui a été préchauffé à 37 degrés Celsius. Après le traitement de polarisation, aspirer le média cellulaire de chaque puits et laver soigneusement les cellules trois fois avec un millilitre aliquots de PBS stérile pour PMA, TNF alpha, et interleukin 8 stimulation ou HBSS pour la stimulation acide hypochlorous.

Après avoir retiré le PBS dans l’étape finale de lavage, ajouter un millilitre de supports complets contenant PMA, TNF alpha, ou interleukine 8. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone dans un incubateur cellulaire pendant six heures pour la stimulation alpha TNF et 24 heures pour la pma ou l’interleukine 8 stimulation. Pour les expériences avec de l’acide hypochlorous, après avoir enlevé le HBSS dans l’étape finale de lavage, ajouter un millilitre d’acide hypochlorous fraîchement préparé.

Puis incuber les cellules pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius en présence de 5% de dioxyde de carbone dans un incubateur cellulaire. Après cela, aspirez soigneusement le supernatant des cellules et lavez les cellules trois fois avec un millilitre aliquots de HBSS. Après avoir retiré le HBSS de l’étape finale de lavage, ajoutez un millilitre de médias culturels RPMI-1640 complets.

Puis incuber les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius en présence de 5% de dioxyde de carbone dans un incubateur cellulaire. Préparer le colorant vert SYTOX dans HBSS à une concentration de 40 micromolaires. Ajouter directement 25 microlitres du colorant à chaque puits contenant du HMDM.

Incuber les cellules à température ambiante pendant 5 minutes dans l’obscurité. Placez ensuite le HMDM dans les puits de culture tissulaire au stade du microscope d’un microscope fluorescent inversé pour l’imagerie. Allumez une source de lumière fluorescente à large spectre, une source lumineuse à champ lumineux et un microscope inversé installé avec un appareil photo numérique couleur haute résolution.

Faites pivoter la roue filtrante à la position numéro deux pour la fluorescence verte avec excitation à 504 nanomètres et dimension à 523 nanomètres. En utilisant l’objectif 5X, concentrez l’image avec la mise au point grossière, puis les boutons de mise au point fine sur le microscope jusqu’à ce que l’image semble nette, claire et ciblée. Passez du microscope au mode Caméra.

Démarrez le logiciel associé. Cliquez sur le bouton Lecture pour prévisualiser l’image et ajuster le bouton de mise au point fine sur le microscope jusqu’à ce que l’image semble nette, claire et focalisée dans la fenêtre d’aperçu du logiciel. Cliquez sur le bouton Capture.

Dans le logiciel, cliquez sur Fichier. Enregistrer comme le type de fichier d’image requis. Au microscope, faites pivoter la roue filtrante à la position numéro cinq pour l’imagerie à champ lumineux et répétez les procédures de capture pour obtenir l’image correspondante à champ lumineux.

Des images en champ lumineux montrant les changements morphologiques de HMDM en réponse aux stimuli sont montrées ici. Les macrophages polarisés par M1 provenant d’expériences avec HMDM exposées à l’interféron gamma et au lipopolysaccharide ont montré une forme cellulaire allongée et en forme de fuseau. À titre de comparaison, la morphologie des macrophages polarisés par M2 après l’exposition de HMDM à l’interleukine 4 pendant 48 heures était généralement ronde et plate.

La capacité des phénotypes différenciés de HMDM de libérer des METs a été visualisée par la formation image de fluorescence de cellules vivantes avec le vert de SYTOX. Le contrôle obtenu de chaque phénotype de HMDM incubé pendant 24 heures en l’absence de tous les stimulus pro-inflammatoires a montré la coloration verte très limitée. La coloration positive pour des METs, montrée comme stries vertes, a été réalisée avec l’exposition des M1-HMDMs à l’acide hypochlorous, PMA, interleukin 8, ou alpha de TNF.

La présence d’une certaine coloration verte apparente dans les cellules reflète la perte de l’intégrité de la membrane qui peut résulter de la mort cellulaire qui est indépendante de la libération extracellulaire de piège. Les expériences réalisées avec des M2-HMDMs exposés à l’interleukine 4 n’ont montré aucune libération d’ADN des cellules, comme indiqué par l’absence des brins ou des stries de l’ADN extracellulaire. Cependant, il y avait une certaine absorption cellulaire du colorant fluorescent vert avec l’acide hypochlorous et l’alpha de TNF.

Il est important d’éviter la lumière vive directe qui peut surexposer la coloration avant l’imagerie. L’ADN extracellulaire peut être quantifié par l’analyse qPCR sur l’ADN nucléaire et mitochondrial présent dans le supernatant cellulaire. Une caractérisation plus détaillée de la structure du mât et de ses rôles dans l’inflammation chronique à l’aide de HMDM peut être plus pertinente sur le plan clinique par rapport à d’autres macrophages immortalisés de lignée cellulaire.