Évaluation des effets des composés sur le développement du réseau de neurones vertébrés fonction à l’aide de rangées d’électrodes multiples de perturbateurs endocriniens

L’objectif global de ce protocole expérimental est de tester les effets des composés perturbateurs endocriniens, comme les bisphénols, sur l’activité de pic de réseau des réseaux neuronaux de vertébrés établis sur des réseaux multi-électrodes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en neurobiologie du développement et en toxicologie environnementale, telles que le mécanisme d’action des toxines environnementales sur le développement de l’activité du réseau dans le cerveau embryonnaire. Le principal avantage de cette technique est que les effets sur les paramètres du réseau neuronal, tels que la vitesse de décharge moyenne, le nombre total de pointes et l’amplitude des pointes ainsi que la synchronie, peuvent maintenant être étudiés.

Notre étude précédente a montré que les EDC affectent le mot et le comportement qui est une sortie directe des réseaux neuronaux, et notre protocole vise maintenant à comprendre l’effet des EDC sur ces réseaux. Le jour de l’installation des neurones, retirez une fiole de matrice extracellulaire du congélateur à moins 20 degrés Celsius, vaporisez de l’éthanol à 70 % et placez-la sur de la glace. Assurez-vous de décongeler la matrice extracellulaire sur de la glace.

Ne pas décongeler à température ambiante car l’ECM polymérise au-dessus de zéro degré Celsius. Travaillez dans la hotte BSL2 pour diluer la matrice extracellulaire à 25 % en ajoutant 300 microlitres de milieu neurobasal froid à l’aliquote de 100 microlitres. Ensuite, à l’aide d’une pipette P200, ajoutez 100 microlitres de solution de matrice extracellulaire à 25 % au centre du réseau multi-électrodes en prenant soin de ne pas toucher les électrodes.

Retirez immédiatement l’ECM en laissant une fine pellicule sur la surface. Couvrez le réseau multi-électrodes et placez-le dans l’incubateur de culture tissulaire jusqu’à ce qu’il soit prêt à plaquer les neurones. Commencez l’isolement des neurones de poussin en stérilisant la coquille externe d’un œuf E7 avec de l’éthanol à 70 %.

Il est important de maintenir des conditions stériles à partir de ce moment. Assurez-vous que tous les instruments sont stérilisés avec de l’éthanol à 70 % et que les solutions sont stériles. Il est utile d’utiliser une cagoule de dissection, mais elle n’est pas absolument nécessaire pour les dissections si elle est effectuée rapidement.

Ensuite, après avoir récupéré et décapité l’embryon, coupez autour des yeux et retirez les globes oculaires. Ensuite, utilisez la pince fine Dumont numéro cinq et des ciseaux à ressort pour faire une incision sur le côté ventral et retirez les couches externes de la peau pour exposer le cerveau antérieur et le tectum optique. Pelez et retirez soigneusement la membrane de la peau.

Transférez le cerveau antérieur dans une autre boîte de Pétri contenant HBSS et coupez-le en petits morceaux d’environ deux millimètres avec des ciseaux à ressort. À l’aide d’une pipette de transfert stérile, les morceaux de cerveau antérieur sont transférés dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Une fois que les morceaux de cerveau antérieur ont coulé au fond du tube de centrifugation, retirez autant de HBSS que possible.

Ensuite, ajoutez un millilitre d’EDTA préchauffé à 0,5 % de trypsine et laissez incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. À l’aide d’une pipette Pasteur, vous pourrez retirer délicatement la trypsine sans déranger les morceaux de tissu. Ajoutez un millilitre de milieu neurobasal et laissez les morceaux de tissu couler au fond.

Après avoir retiré le milieu et répété le lavage, ajoutez deux millilitres de milieu neurobasal et triturez doucement jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de morceaux de tissu. Diluez les cellules remises en suspension d’un à 10 avec un milieu neurobasal. Comptez les cellules viables à l’aide d’un colorant bleu trypan et d’un hémocytomètre.

Après le comptage, plaquez les cellules dissociées sur des réseaux multi-électrodes recouverts d’ECM à une densité de 2 200 cellules par millimètre carré. Le lendemain, ajoutez 10 micromolaires de BPA en milieu neurobasal aux réseaux multi-électrodes traités. Le jour de l’acquisition, remplacer le milieu de culture par un milieu neurobasal frais et remettre les puces dans l’incubateur de CO2 pendant au moins deux heures avant l’enregistrement.

Démarrez le logiciel d’enregistrement et réglez la température du réseau multi-électrodes à 37 degrés Celsius en cliquant sur l’icône de température. Définissez les paramètres d’acquisition en sélectionnant les flux dans le panneau de gauche et en cliquant avec le bouton droit de la souris sur l’icône de la muse. Ensuite, sélectionnez ajouter un traitement et un détecteur de pointes et cliquez sur OK dans la fenêtre contextuelle.

Spike detector six de STD apparaîtra sous le nom du fichier. Ensuite, faites un clic droit sur le détecteur de pointes, sélectionnez ajouter un traitement et un détecteur de rafale et cliquez sur OK dans la fenêtre contextuelle. Le détecteur de rafale ISI apparaîtra sous l’icône de la muse.

Ensuite, faites un clic droit sur le détecteur de rafale, sélectionnez ajouter un compilateur de traitements et de statistiques neuronales. Dans la fenêtre contextuelle, assurez-vous que l’en-tête de fichier, les statistiques de puits agrégées et la synchronisation sont sélectionnés, puis cliquez sur OK. Le compilateur de statistiques apparaîtra ci-dessous. Cliquez sur l’icône de l’horloge en bas de l’écran et modifiez les informations dans la section des paramètres pour enregistrer toutes les 5,1 minutes et enregistrer pendant cinq minutes.

Celle-ci sera lancée immédiatement et sera exécutée une fois. Après avoir récupéré le réseau multi-électrodes de l’incubateur, placez-le sur l’unité d’enregistrement et verrouillez-le en place. Commencez à enregistrer l’activité du réseau en cliquant sur démarrer l’enregistrement dans la section d’enregistrement programmé.

En règle générale, une durée d’enregistrement de cinq minutes est suffisante, bien que des enregistrements plus longs allant jusqu’à 10 minutes puissent être obtenus. Après l’enregistrement, remettez le réseau multi-électrodes dans l’incubateur. Le nombre moyen de pointes est significativement plus faible dans les cultures de cerveau antérieur de poussin E7 traitées au BPA par rapport aux cultures témoins.

L’indice de synchronie moyen est significativement plus faible dans les cultures de cerveau antérieur de poussin E7 traitées au BPA par rapport aux cultures témoins. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de trois heures si elle est bien faite. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir des conditions stériles à tout moment, même pendant l’enregistrement de l’activité de pointe.

À la suite de cette procédure, l’effet de médicaments potentiels, comme les antiépileptiques et les antidépresseurs, sur l’activité du réseau peut être évalué comme une étape vers la compréhension de leur mécanisme d’action. De nombreux EDC ont des effets subtils sur le cerveau au cours du développement qui se manifestent par des changements de comportement. Le comportement est un résultat direct de l’activité réseau sous-jacente.

Notre protocole vise à disséquer les effets de ces composés sur l’activité du réseau.