Stimulation optogénétique et enregistrement électrophysiologique d’événements synaptiques dans des coupes de cerveau de rat

Commencez par une tranche de cerveau de rat contenant la région neuronale cible connectée à un axone sensible à la lumière d’une autre région du cerveau.

Placez la tranche dans la chambre d’enregistrement immergée et fixez-la avec une ancre de tranche.

Au microscope, localisez la couche souhaitée et identifiez le neurone pyramidal cible.

Soulevez l’objectif du microscope pour créer un ménisque avec la surface de la tranche.

Abaissez une micropipette en verre remplie de solution d’enregistrement intracellulaire dans ce ménisque.

Touchez la cellule pyramidale identifiée avec la pointe de la pipette pour créer une encoche dans la membrane.

Appliquez une aspiration pour former un joint.

Augmentez l’aspiration jusqu’à ce que la membrane se rompe, établissant une configuration à cellules entières.

À l’aide d’une source lumineuse montée, appliquez des impulsions lumineuses sur la tranche.

Ces impulsions lumineuses déclenchent un potentiel d’action dans l’axone sensible à la lumière, libérant des neurotransmetteurs au niveau de la fente synaptique.

Enregistrez les réponses du neurone pyramidal à ces libérations pour analyser l’efficacité synaptique.

Pour l’identification de la cellule cible, placez la tranche dans la chambre d’enregistrement et immobilisez-la à l’aide d’une ancre de tranche. Sous un faible grossissement, à l’aide d’un éclairage infrarouge, accédez à la couche LEC 5. Ensuite, passez à l’objectif d’immersion dans l’eau à fort grossissement et identifiez les neurones pyramidaux.

Marquez la position de la cellule sur le moniteur à l’aide de ruban adhésif. Ensuite, pour former une pince patch à cellules entières, fabriquez une micropipette en verre borosilicate et remplissez-la d’une solution d’enregistrement intracellulaire. Placez la micropipette remplie dans le porte-électrode et appliquez une pression positive en soufflant fort dans un embout buccal relié à l’orifice latéral du porte-électrode.

Soulevez l’objectif du microscope de manière à ce qu’un ménisque se forme et insérez l’électrode dans le ménisque jusqu’à ce qu’elle soit visible au microscope. Ouvrez la fenêtre de test d’étanchéité et déterminez si la résistance de la pipette est de trois à cinq mégaohms. Ensuite, touchez la cellule identifiée avec la pointe d’une pipette, ce qui entraîne une indentation dans la membrane cellulaire.

Ensuite, appliquez une pression négative par aspiration au niveau de l’embout buccal, ce qui augmente la résistance de la pipette. Continuez à appliquer une pression négative progressivement jusqu’à ce que la membrane cellulaire se rompe, ce qui entraîne des transitoires de capacité de la cellule entière. Pour entrer dans la configuration de pince de courant, utilisez une LED montée dirigée dans le trajet de la lumière du microscope avec des cubes de filtre et des optiques appropriées, et appliquez des impulsions lumineuses sur la tranche via l’objectif 40x. Diffusez des trains de plusieurs impulsions lumineuses à 5 Hertz, 10 Hertz et 20 Hertz pour étudier les propriétés de libération présynaptique.