Immunomarquage d’astrocytes marqués par fluorescence dans une coupe de tissu cérébral de souris

Prenez une section de tissu cérébral de souris fixe contenant une population clairsemée d’astrocytes exprimant une protéine fluorescente.

Traitez la section flottante avec un tampon contenant un détergent pour perméabiliser les cellules.

Incuber la section dans un tampon de blocage pour empêcher la liaison d’anticorps non spécifiques.

Traitez la section avec des anticorps primaires et incubez pour permettre aux anticorps de se lier aux protéines fluorescentes dans les astrocytes.

Lavez tout excès d’anticorps primaires à l’aide d’un tampon.

Ensuite, incubez la section avec des anticorps secondaires marqués au fluorophore qui se lient aux anticorps primaires.

Lavez les anticorps secondaires non liés à l’aide d’un tampon.

Transférez la section dans un mélange d’eau tampon déminéralisée pour éliminer les résidus de détergent.

Placez la section sur une lame contenant de l’eau déminéralisée tampon. Retirez l’excès de liquide et ajoutez du support de montage. Ensuite, positionnez une lamelle et fixez-la.

Enfin, utilisez la microscopie confocale pour visualiser les astrocytes exprimant des protéines fluorescentes marqués dans la coupe.

Pour commencer, préparez une nouvelle solution de TBST en ajoutant 1 millilitre de Triton X à 10 % dans un tube de 50 millilitres et en remplissant le tube à 50 millilitres de TBS. Préparez 2 millilitres de solutions de blocage et d’anticorps pour chaque cerveau en combinant du sérum de chèvre et du TBST dans un tube de 15 millilitres.

Ensuite, étiquetez une plaque de 24 puits pour placer différents échantillons dans différentes rangées, dans différentes solutions, dans différentes colonnes. Ensuite, ajoutez 1 millilitre de TBST aux trois premières colonnes étiquetées « Wash 1 », « Wash 2 » et « Wash 3 », et ajoutez 1 millilitre de solution bloquante à la quatrième colonne.

Préparez un pic en verre en faisant fondre l’extrémité d’une pipette Pasteur de 5,75 pouces dans un petit crochet à l’aide d’un bec Bunsen. Transférez ensuite des sections de tissu de la plaque à 12 puits dans la colonne « Wash 1 » de la plaque à 24 puits à l’aide du pic. Ensuite, lavez les sections pendant 10 minutes chacune dans les puits Wash 1, 2 et 3 en utilisant le pic en verre pour transférer les sections d’un puits à l’autre, puis en incubant les sections pendant une heure dans la solution de blocage.

Ensuite, incubez les sections dans l’anticorps primaire pendant deux à trois nuits à 4 degrés Celsius tout en agitant. Après l’incubation primaire de l’anticorps, aspirer le premier jour de TBST à partir des puits de lavage. Ajoutez ensuite 1 millilitre de nouveau TBST dans chaque puits de lavage et déplacez les sections dans le premier puits de lavage.

Ensuite, incubez des sections dans l’anticorps secondaire pendant trois heures à température ambiante. Après l’incubation secondaire de l’anticorps, aspirer le TBST du deuxième jour des puits de lavage. Ajoutez ensuite 1 millilitre de nouveau TBST dans chaque puits de lavage et déplacez les sections dans le premier puits de lavage.

Lors du lavage final, retirez le support de montage à partir de 4 degrés Celsius et laissez-le se réchauffer à température ambiante. Préparez ensuite un mélange de 2 à 1 de TBS dans de l’eau déminéralisée et ajoutez-le dans une boîte de Pétri. Ensuite, préparez une lame de microscope en ajoutant 800 microlitres de 2 à 1 mélange de TBS dans de l’eau désionisée à la surface.

Transférez les sections du puits « Wash 3 » dans la boîte de Pétri. Ensuite, à l’aide d’un pinceau fin, transférez les sections une à une de la boîte de Pétri dans le liquide sur la lame. Ensuite, disposez soigneusement les sections de manière à ce qu’elles soient à plat sur la lame à l’aide du pinceau. Retirez délicatement l’excès de liquide de la lame à l’aide d’une pipette P1000, puis effectuez une aspiration sous vide.

Une fois que tout l’excès de liquide est retiré de la lame, utilisez une pipette de transfert pour ajouter immédiatement une goutte de support de montage à chaque section et posez doucement une lamelle sur la lame. Laissez le support de montage s’étaler pendant quelques minutes, puis retirez tout support de montage en excès qui sort de sous la lamelle par aspiration sous vent. Ensuite, scellez les quatre bords de la lamelle avec du vernis à ongles transparent.