Why measure mitochondrial respiratory chain subunits for target validation?

Quantifying mitochondrial respiratory chain complex subunits enables assessment of target engagement effects on neuronal energy metabolism, supporting mechanistic de-risking in neurodegenerative disease programs.

How does isolating mitochondrial protein expression as an independent variable support discovery pipelines?

Isolating mitochondrial protein expression allows researchers to link specific targets or compounds to changes in energy metabolism, clarifying biological function in early discovery.

What do quantitative measurements of mitochondrial DNA levels enable in neuronal studies?

Quantitative mitochondrial DNA measurements provide a proxy for mitochondrial content and biogenesis, enabling normalization of functional readouts and assessment of organelle density.

Why are replication requirements important for cross-functional collaboration in mitochondrial profiling?

Replication ensures consistent, reproducible quantification of mitochondrial parameters across teams and sites, supporting reliable data transfer in target validation and assay development.

What statistical analysis capabilities are required before implementing this flow cytometry method?

Implementation requires the ability to analyze mean fluorescence intensity, calculate coefficients of variation, and apply statistical tests to compare mitochondrial protein expression across experimental conditions.

Mesure de plusieurs paramètres mitochondriaux dans les neurones à l’aide de la cytométrie en flux

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

0 views • 2:09 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prenez des neurones fixes et perméabilisés dans un tube.

Ajoutez un tampon de blocage pour empêcher la liaison d’anticorps non spécifiques.

Centrifuger la suspension et retirer le surnageant. Ensuite, résuspendez les neurones dans le tampon.

Transférez la suspension également dans des tubes contenant des anticorps primaires non marqués et marqués au fluorophore.

Incuber, permettant aux anticorps de se lier spécifiquement à la chaîne respiratoire mitochondriale ou aux sous-unités du complexe MRC, à une protéine associée à l’ADN mitochondrial et à une protéine de la membrane externe mitochondriale dans les neurones.

Retirez tous les anticorps non liés.

Incuber avec des anticorps secondaires marqués au fluorophore qui se lient aux anticorps primaires non marqués.

Centrifugez le mélange et jetez le surnageant.

Remettez les neurones en suspension dans le tampon et transférez-les dans des tubes de microcentrifugation.

Effectuer une cytométrie en flux pour détecter les signaux fluorescents sur les neurones marqués, correspondant aux niveaux d’expression des sous-unités du complexe MRC et à la mesure des niveaux relatifs d’ADN mitochondrial.

Bloquer les échantillons dans 1 millilitre de tampon de blocage, et laver les cellules par centrifugation avec du PBS comme démontré. Pour détecter différents complexes et sous-unités mitochondriaux, incubez les cellules pendant 30 minutes avec les anticorps primaires respectifs décrits dans le manuscrit. Après avoir lavé les cellules une fois avec du PBS, incubez les cellules avec l’anticorps secondaire pendant 30 minutes.

À la fin de l’incubation, laver et remettre en suspension les cellules dans le PBS comme démontré. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre, conservé dans l’obscurité, sur de la glace. Ensuite, analysez les cellules sur le cytomètre en flux, détectez les signaux et filtrez-en un à l’aide d’un filtre passe-bande 530/30.