Génération d’un modèle sphéroïde tridimensionnel d’invasion de cellules tumorales

Prenez une culture de cellules tumorales cérébrales humaines.

Traiter avec une enzyme de dissociation pour perturber les jonctions cellulaires, en séparant les cellules agrégées.

Laver avec un tampon pour arrêter l’activité enzymatique, puis ajouter un milieu de culture pour maintenir la viabilité cellulaire.

Introduisez de la méthylcellulose, un agent de suspension.

Transfère la suspension dans une microplaque à fond rond et incuber.

La méthylcellulose visqueuse maintient les cellules en suspension, favorisant les interactions cellule-cellule pour l’agrégation en sphéroïdes.

Mélangez les sphéroïdes avec une matrice de collagène qui imite l’environnement extracellulaire physiologique.

Transférez la suspension dans une microplaque et incuberez, permettant à la matrice de former un gel qui piège les sphéroïdes.

Ajouter le milieu de croissance sur le gel.

À la périphérie sphéroïde, les cellules tumorales perdent leur adhésion cellule-cellule et adoptent un phénotype invasif.

Ces cellules sécrètent des protéases pour dégrader la matrice, étendent les protubérances pour s’ancrer et avancent, envahissant la matrice.

Le modèle sphéroïde présentant une invasion tumorale est prêt pour l’analyse.

Pour générer des sphéroïdes tumoraux de taille uniforme, lavez d’abord la culture de cellules tumorales d’intérêt avec 5 millilitres de PBS et traitez les cellules avec 0,5 à 1 millilitre d’enzyme de dissociation. Après 5 minutes à 37 degrés Celsius, arrêtez la réaction avec 4 à 4,5 millilitres de PBS et transférez les cellules détachées dans un tube conique de 15 millilitres, contenant 10 millilitres de milieu de croissance complet.

Après le comptage, remettre les cellules en suspension à raison de 1 fois 10 à 6 cellules par 8 millilitres de milieu de croissance complet, complété par 2 millilitres de concentration de méthylcellulose à 2 %, et transférer la suspension dans un récipient stérile. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de cellules dans chaque puits d’une plaque à fond rond de 96 puits et placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant trois à quatre jours.

Pour effectuer un test d’invasion, lorsque les cellules tumorales ont formé des sphéroïdes de taille uniforme, transférez chaque structure cellulaire dans un tube de 500 microlitres et lavez les sphéroïdes une fois avec 200 microlitres de PBS. Après le deuxième lavage, transférez soigneusement les sphéroïdes dans 100 microlitres de matrice de collagène fraîchement préparée, et ajoutez chaque suspension de sphéroïde au centre de chaque puits d’une plaque à fond plat de 96 puits.

Après une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius, ajoutez 100 microlitres de milieu de croissance complet sur le gel dans chaque puits.

Assurez-vous de placer tous les sphéroïdes au centre de chaque puits pour obtenir la meilleure imagerie de l’invasion des cellules tumorales.