Visualisation de l’afflux de calcium dans les neurones du mésencéphale ventral dérivé d’embryons de souris

Prenez une lamelle avec une culture de neurones du mésencéphale ventral dérivé d’embryons de souris.

Les cellules sont infectées par un vecteur viral pour exprimer un indicateur calcique.

Transférez la lamelle dans la chambre d’enregistrement d’un microscope confocal perfusé avec un tampon d’enregistrement.

À l’aide de la lumière visible, identifiez une région contenant plusieurs neurones, puis passez à l’imagerie par fluorescence.

À de faibles niveaux de calcium intracellulaire, l’indicateur reste non lié, présentant une faible intensité de fluorescence.

Les propriétés intrinsèques des neurones génèrent des potentiels d’action spontanés, déclenchant l’ouverture et l’afflux de calcium.

L’excès de calcium se lie à l’indicateur, induisant un changement de conformation qui augmente l’intensité de la fluorescence.

Enregistrez l’intensité de la fluorescence au fil du temps pour suivre l’activité calcique spontanée.

Introduisez un neurotransmetteur à haute concentration, qui se lie aux récepteurs des neurones, générant des potentiels d’action continus.

L’activation soutenue du canal calcique voltage-dépendant prolonge l’afflux de calcium, provoquant une augmentation soutenue de l’intensité de la fluorescence.

Préparez 1 litre de tampon d’enregistrement HEPES, 200 millilitres de tampon d’enregistrement de glutamate de 20 micromolaires et 200 millilitres de tampon d’enregistrement NBQX de 10 micromolaires selon les instructions du manuscrit. Remplissez une boîte de Pétri millimétrique stérile avec 3 millilitres de tampon d’enregistrement.

Prenez la boîte de Pétri avec les cultures infectées de l’incubateur, puis saisissez soigneusement le bord d’une lamelle à l’aide d’une pince à pointe fine et transférez-la dans la boîte avec le tampon d’enregistrement. Remettez la lamelle restante dans le milieu dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et transportez la boîte avec le tampon d’enregistrement vers le microscope confocal.

Démarrez le logiciel d’imagerie. Pendant l’initialisation, démarrez la pompe péristaltique et placez la ligne dans la mémoire tampon d’enregistrement. Calibrez ensuite le débit à 2 millilitres par minute. Transférez la lamelle infectée de la boîte de Pétri dans le bain d’enregistrement à l’aide d’une pince fine. À l’aide de l’objectif à immersion dans l’eau 10x et de la lumière en fond clair, trouvez le plan de mise au point et recherchez une région avec une forte densité de corps cellulaires neuronaux. Passez ensuite à l’objectif 40X et recentrez l’échantillon.

Sélectionnez et appliquez Alexa Flour 488 dans la fenêtre de liste des colorants. Afin d’éviter la surexposition et le photoblanchiment des fluorophores, commencez par des réglages de faible HV et de puissance laser. Pour le canal Alexa Fluor 488, réglez le HV sur 500, le gain sur 1x et le décalage sur zéro. Réglez la puissance à 5 % pour la ligne laser 488, augmentez la taille du sténopé à 300 micromètres et utilisez l’option de balayage Focus x2 pour ajuster de manière optimale les signaux d’émission à des niveaux inférieurs à la saturation.

Les paramètres peuvent ensuite être ajustés pour une visibilité optimale de chaque canal. Une fois les paramètres du microscope optimisés, déplacez la platine pour localiser une région avec plusieurs cellules affichant des changements spontanés de fluorescence GCaMP6f, et faites la mise au point sur le plan souhaité pour l’imagerie. À l’aide de l’outil Clip Rect Capture, vous pouvez découper l’image d’image à une taille permettant d’atteindre un intervalle d’un peu moins d’une seconde. Définissez la fenêtre d’intervalle sur 1,0 et la fenêtre Num sur 600.

Pour capturer une vidéo de la série T, sélectionnez l’option de temps, puis utilisez l’option de numérisation XYt pour commencer l’imagerie. Surveillez la barre de progression de l’imagerie et déplacez la ligne du tampon d’enregistrement HEPES dans le tampon d’enregistrement de glutamate de 20 micromolaires au moment approprié. Une fois l’imagerie terminée, sélectionnez le bouton Série terminée et enregistrez le film de la série T terminé. Continuez à perfuser le glutamate pendant cinq minutes supplémentaires, de sorte que les neurones en culture aient été exposés au glutamate pendant un total de 10 minutes.

Répétez ce processus pour chaque lamelle à imager. Il est possible de voir des traces de calcium dans les corps cellulaires neuronaux immédiatement après l’expérience. Utilisez l’outil ellipse pour dessiner le nombre souhaité de ROI autour du soma neuronal, et utilisez le bouton d’analyse de série pour visualiser les traces. Après cinq minutes d’exposition supplémentaire au glutamate, retirez la lamelle du bain à l’aide d’une pince fine et remettez-la dans la boîte de Pétri avec le tampon d’enregistrement jusqu’à ce que toute l’imagerie soit terminée.