Application d'une souris ligaturés Assay Peyer Patch anse intestinale pour évaluer absorption par les cellules bactériennes M

L'objectif général de cette procédure est d'examiner la prise en charge bactérienne par les cellules M situées au sein du système immunitaire muqueux intestinal. La première étape de cette procédure consiste à exposer et ligaturer les plaques pyloreuses intestinales d'une souris anesthésiée. Des bactéries fluorescentes sont ensuite injectées dans la zone ligaturée.

Une heure plus tard, les fragments de tissus sont excisés. Les cellules du tissu sont ensuite perméabilisées et marquées avec l'anticorps dirigé contre le marqueur des cellules M, GP deux. Enfin, les échantillons sont observés au microscope confocal et les bactéries en cours de transcytose par les cellules M peuvent être visualisées.

En plus de fournir des informations sur la base moléculaire de la transcytose bactérienne par les cellules M, cette méthode peut être appliquée à d'autres systèmes. Par exemple, ce protocole pourrait être utilisé pour étudier la perméabilité cellulaire et l'intestin encadré à l'aide de chlorure et de micro-organismes. À l’aide d’un répandeur en verre stérile, étaler les bactéries fluorescentes sur une plaque de gélose LB et incuber la plaque à 37 degrés Celsius jusqu’à l’apparition de colonies isolées. Prélever une colonie unique sur la gélose solide et l’ensemencer dans deux millilitres de milieu LB frais.

Ensuite, cultiver les bactéries en agitant durant la nuit à 37 degrés Celsius. Une fois que la culture initiale a poussé, transférer 500 microlitres de bactéries dans 4,5 millilitres de milieu LB et incuber cette nouvelle culture à 37 degrés Celsius pendant trois à quatre heures, ou jusqu'à ce que sa densité optique à 600 nanomètres atteigne un, indiquant que la croissance bactérienne est en phase logarithmique. À ce stade, centrifuger la culture à 3000 ×g pendant cinq minutes à 4 degrés Celsius pour récolter les bactéries ; après la centrifugation, jeter le surnageant et laver le culot avec 5 millilitres de PBS stérile. Après avoir répété l'étape de lavage, resuspendre les bactéries dans 5 millilitres de PBS.

Après avoir placé la souris sous anesthésie continue à l'isoflurane, utilisez des outils stériles pour ouvrir aseptiquement l'abdomen de la souris. Commencez par exposer l'intestin grêle et localisez les plaques de Peyer. Une fois les plaques de Peyer repérées, utilisez un fil de suture stérile pour ligaturer l'intestin à environ cinq millimètres d'un côté de la plaque.

Veiller à ne pas sectionner les vaisseaux sanguins pendant la procédure. Une fois l'intestin ligaturé, utiliser une seringue pour injecter 50 microlitres de suspension bactérienne d'environ 107 UFC dans la boucle du patch ligaturé au niveau de la face libre de l'intestin. Ensuite, utiliser du fil pour ligaturer l'autre côté de l'intestin.

Fermez l'abdomen de la souris à l'aide d'une pince et maintenez la souris sous anesthésie pendant une heure avant de la sacrifier. Pour prélever la plaque pyrénique, excisez soigneusement la plaque pyrénique. Ensuite, rincez vigoureusement la section intestinale prélevée plusieurs fois au PBS afin de laver la face apicale de la plaque PI et d'éliminer les fluides muqueux et les bactéries en excès.

Une fois que le patch de PI a été lavé, placez-le dans un puits d'une plaque 24 puits et ajoutez la solution cyto effects ou cyto perm. Incubez l'échantillon sur de la glace pendant une heure. Une fois que le patch de P'S est fixé, imbibez-le dans un millilitre de tampon de lavage perm pendant cinq minutes.

Répétez cette étape de lavage trois fois. Ensuite, placez l'échantillon dans un millilitre de tampon de blocage et incubez-le sur de la glace pendant 30 minutes. Après l'étape de blocage, ajoutez l'anticorps monoclonal anti-souris GP2 à une concentration finale de cinq microgrammes par millilitre et incubez l'échantillon toute la nuit à quatre degrés Celsius pour marquer les cellules M.

Ensuite, lavez l'échantillon comme précédemment. Ajoutez un anticorps secondaire conjugué et incubez l'échantillon sur glace, à l'abri de la lumière, pendant deux heures. Une fois l'échantillon marqué, lavez délicatement l'échantillon au PBS.

Ensuite, placez trois ou quatre morceaux de lamelles circulaires sur une lame et immergez la préparation dans 200 microlitres d'une solution de glycérol à 30 % dans du PBS. Sur la lame, utilisez un microscope confocal à laser DM IRE2 ou un microscope de restauration Delta Vision avec déconvolution pour observer l'échantillon. Sur cette image, on peut voir que Salmonella typhimurium marquée en vert par la GFP est entourée par GP2, visualisée en rouge sur la membrane plasmique apicale.

Dans cette image tournée, des bactéries sont visibles à l'intérieur des vésicules cytoplasmiques sous-apicales. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'évaluer la transcytose bactérienne par les cellules M en utilisant l'essai intestinal ligaturé de Lu pys.