Application d'une souris ligaturés Assay Peyer Patch anse intestinale pour évaluer absorption par les cellules bactériennes M

L’objectif global de cette procédure est d’examiner l’absorption bactérienne par les cellules M situées dans le système immunitaire de la muqueuse intestinale. La première étape de cette procédure consiste à exposer et à ligaturer les plaques de bûchers intestinaux d’une souris anesthésiée. Des bactéries fluorescentes sont ensuite injectées dans la zone ligaturée.

Une heure plus tard, les plaques de bûchers sont excisées. Les cellules du tissu sont ensuite imprégnées et colorées pour le marqueur de cellules M, GP deux. Enfin, les échantillons sont observés à l’aide d’un microscope confocal et les bactéries en transcytose par les cellules M peuvent être visualisées.

En plus de fournir un aperçu de la base moléculaire de la transcytose bactérienne par les cellules m, le rejet peut être appliqué à d’autres systèmes. Par exemple, ce protocole pourrait être utilisé pour aider à la perméabilité cellulaire et dans l’intestin encadré à l’aide de chlore et de microbes À l’aide d’un étaleur de verre stérile, striez les bactéries fluorescentes sur une plaque de tarière LB et incubez la plaque à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que des colonies uniques soient visibles. Prélevez une seule colonie de la tarière solide et inoculez-la dans deux millilitres de milieu LB frais.

Ensuite, cultivez les bactéries sur un shaker pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Une fois que la culture de démarrage s’est développée, transférez 500 microlitres de bactéries dans 4,5 millilitres de milieu LB et incubez cette nouvelle culture à 37 degrés Celsius pendant trois à quatre heures ou jusqu’à ce que sa densité optique à 600 nanomètres atteigne un, indiquant que la croissance bactérienne est en phase logarithmique. À ce stade, centrifugez la culture à 3000 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour récolter les bactéries après la centrifugation, jetez le piège et lavez la pastille avec cinq millilitres de PBS stérile Après avoir répété l’étape de lavage, Resus suspendez les bactéries dans cinq millilitres de PBS.

Après avoir placé la souris sous anesthésie continue au fluor, utilisez des outils stériles pour ouvrir aseptiquement l’abdomen de la souris. Commencez par exposer l’intestin grêle et localisez les plaques de l’IP. Une fois que les patchs d’un IP ont été trouvés, utilisez du fil à coudre stérile pour ligaturer l’intestin d’environ cinq millimètres d’un côté du patch.

Prenez soin d’éviter de sectionner les vaisseaux sanguins pendant la procédure. Une fois l’intestin ligaturé, utilisez une seringue pour injecter 50 microlitres de suspension bactérienne environ 10 à sept UFC dans l’anse de patch des bûchers ligaturés sur le côté lâche de l’intestin. Ensuite, utilisez du fil pour ligaturer l’autre côté de l’intestin.

Fermez l’abdomen de la souris à l’aide d’une pince et maintenez-la sous anesthésie pendant une heure avant de l’euthanasier. Pour récolter le champ de bûchers, excisez soigneusement le champ de bûchers. Ensuite, rincez vigoureusement le PBS à travers la section récoltée de l’intestin plusieurs fois pour laver la face apicale du patch de l’IP et éliminer l’excès de liquide muqueux et les bactéries.

Une fois le patch du PI lavé, placez-le dans un puits d’une plaque à 24 puits et ajoutez des effets cyto ou une solution de permanente cyto. Incuber l’échantillon sur de la glace pendant une heure. Une fois le patch P’S fixé, trempez-le dans un millilitre de tampon de lavage permanent pendant cinq minutes.

Répétez cette étape de lavage trois fois. Placez ensuite l’échantillon dans un millilitre de tampon de blocage et incubez-le sur de la glace pendant 30 minutes. Après l’étape de blocage, ajoutez l’anticorps monoclonal anti-souris GP two à une concentration finale de cinq microgrammes par millilitre et incubez l’échantillon pendant la nuit à quatre degrés Celsius pour colorer les cellules M.

Ensuite, lavez l’échantillon comme précédemment. Ajoutez un étage secondaire pour les anticorps conjugués et incubez l’échantillon sur de la glace dans l’obscurité pendant deux heures. Une fois l’échantillon coloré, lavez-le doucement dans du PBS.

Placez ensuite trois ou quatre morceaux de verre de couverture circulaire sur une lame et intégrez le patch pires dans 200 microlitres d’une solution de glycérol à 30 % dans du PBS. Sur la lame, utilisez un microscope laser confocal DM IRE deux ou un microscope à déconvolution de restauration de la vision Delta pour observer l’échantillon. Sur cette image, on peut voir que la salmonella typhimurium marquée en vert GFP est entourée de GP deux montrés en rouge sur la membrane plasmique apicale.

Dans cette image tournée, les bactéries sont visibles à l’intérieur des vésicules cytoplasmiques sous-apicales. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer la transcytose bactérienne par les cellules M à l’aide de Lu asay intestinal ligaturé.