Une méthode de génotypage basé sur la PCR pour distinguer les variétés de type sauvage et les plantes ornementales de Imperata cylindrica

L’objectif principal de cette procédure est de fournir un protocole de génotypage moléculaire rapide et rentable capable de différencier les variétés de Retta cylindrica, généralement appelée herbe de gon, qui ne peuvent pas être distinguées par la seule morphologie. Pour ce faire, il suffit d’abord d’identifier et d’isoler les tissus d’une variété d’herbe à gon d’intérêt. L’étape suivante consiste à extraire l’ADN nucléaire et plâtré des tissus collectés.

Ensuite, la réaction en chaîne par polymérase est effectuée sur l’ADN extrait à l’aide d’amorces spécifiques à la variété qui ciblent les différences de séquence dans la région LF de la transformation des PLA, ainsi que des contrôles positifs et négatifs appropriés. La dernière étape consiste à effectuer une électrophorèse sur gel sur chacune des quatre réactions de PCR afin de visualiser les produits de PCR amplifiés. En fin de compte, la variété d’herbe de gon collectée est déterminée par l’analyse de la variété résultante Les interdictions de produits PCR spécifiques sur le gel Les plans invasifs coûtent aux États-Unis environ 3,4 milliards par an, causant des dommages substantiels aux ressources agricoles et naturelles.

L’herbe est l’une des 10 pires mauvaises herbes envahissantes au monde. L’herbe Cogan se propage rapidement dans les mono-peuplements qui déplacent la végétation indigène, et à leur tour, les animaux qui dépendent de cette végétation indigène L’herbe GaN infeste actuellement 490 millions d’hectares dans le monde et environ 500 000 hectares aux États-Unis et la variété ornementale de ti de tus centrica est largement commercialisée sous le nom de tus Centrica, Arbra, Baren rouge et sang japonais grossier comme nous l’appellerons JBG. Cette variété est putativement stérile et non envahissante, et est considérée comme souhaitable pour ses feuilles de couleur rouge.

Dans certaines conditions, l’herbe sanguine japonaise peut produire des graines viables et revenir à une forme entièrement verte qui est indiscernable de l’herbe de cogan de type sauvage. Comme vous pouvez le voir, ils possèdent tous deux des feuilles vertes et sont plus grands que les variétés ornementales traditionnelles avec des feuilles plus grandes. De plus, les plantes de type retourné et sauvage ont des rhizomes plus grands et la variété ornementale augmente son potentiel de reproduction asexuée.

La réversion fait l’identification par la seule morphologie. Une tâche éprouvante. Les méthodes moléculaires permettent de distinguer avec précision les plantes envahissantes et les matières végétales qui ne peuvent pas être identifiées par des moyens visuels normaux.

Les méthodes moléculaires sont essentielles pour se prémunir contre la propagation et l’introduction de plantes envahissantes. L’application de ce protocole moléculaire permet de distinguer avec précision les reverts d’herbe sanguine japonaise de l’herbe Kogan. Ce protocole peut aider à prévenir la cooccurrence avec l’herbe de Kogan et la formation possible d’hybrides viables.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux techniques existantes telles que le polymorphisme de longueur de fragment amplifié, ou l’analyse A FLP et des choses comme le séquençage de l’ADN, est qu’elle fournit une technique de génotypage moléculaire très rentable et rapide qui peut facilement distinguer la différence entre l’herbe kogan de type sauvage et les variétés d’herbe de sang japonaise. La démonstration de la technique sera assurée par Joseph Hery, un étudiant de premier cycle de notre laboratoire. Identifiez d’abord un spécimen d’un site où poussent des graminées à gon ou des graminées sanguines japonaises et doivent être distinguées les unes des autres.

L’herbe sanguine japonaise se distingue facilement de l’herbe à gon de type sauvage par ses feuilles rouge vif. Cependant, le revert de l’herbe sanguine japonaise est presque impossible à distinguer de l’herbe Kogan car ils ont tous deux des feuilles vertes plus longues, une plus grande surface foliaire et des rhizomes plus gros que l’herbe de sang japonaise ornementale. Cette méthode peut être utilisée sur des tissus de feuilles frais, congelés et récemment séchés.

Si vous stockez des tissus pour l’extraction de l’ADN à une date ultérieure, la meilleure méthode est de congeler et de stocker immédiatement les tissus à moins 80 degrés Celsius. Si un stockage à sec est nécessaire, placez le mouchoir dans une enveloppe en papier et conservez l’enveloppe dans du gel de silice déshydraté ou d’autres déshydratants actifs à température ambiante. Si des tissus frais doivent être utilisés, assurez-vous que l’ADN est extrait dans les trois heures suivant le prélèvement pour éviter la dégradation.

Cette procédure utilise le mini kit DNEZ plants de Kyogen selon les instructions du fabricant, avec une modification mineure. Ici. La procédure a été adaptée de manière à ce que plus de 100 milligrammes de tissus frais ou congelés ou plus de 20 milligrammes de tissus séchés soient utilisés. Broyez d’abord plus de 100 milligrammes de tissu foliaire frais ou congelé, ou plus de 20 milligrammes de tissu foliaire sec en une poudre fine à l’aide de trois rondelles d’azote liquide avec broyage dans un mortier et un pilon réfrigérés.

Pesez la poudre congelée de tissu frais ou congelé en aliquotes de 100 milligrammes. Si vous utilisez du tissu foliaire sec, pesez la poudre en aliquotes de 20 milligrammes. Après cette étape, procédez à l’extraction de l’ADN selon les instructions du fabricant à l’aide d’un spectrophotomètre tel que le test du spectrophotomètre NanoDrop, de l’ADN, de la qualité et de la quantité, les bons rendements en ADN doivent être compris entre 50 et 150 nanogrammes par microlitre avec deux rapports de 60 sur deux 80 et 2 32 80 proches de 2,0 comme vu. Ici.

Effectuez l’électrophorèse à l’aide d’un gel AROS standard à 1 %. Vérifiez la présence de bandes relativement grandes de plus de 10 KB sans ou peu de traces dues à la contamination par l’ARN si la concentration d’ADN est élevée, diluez les échantillons à 70 nanogrammes par microlitre pour les étapes suivantes. Les amorces PCR utilisées dans ce protocole, indiquées par les flèches rouge et verte, sont basées sur les différences de séquence entre la région d’espacement LF du tour plâtré de l’herbe de Cogan et les génotypes de l’herbe sanguine japonaise.

Ces différences se présentent sous la forme de polymorphismes mononucléotidiques et d’insertions et de délétions indiquées par les flèches noires verticales, qui permettent le développement d’amorces spécifiques à la variété. En localisant les amorces sur les sites de séquences uniques, les séquences d’amorces sont contenues dans la partie écrite du protocole pour chaque échantillon d’ADN isolé mis en place deux réactions PCR de 50 microlitres dans des tubes PCR à paroi mince de 0,2 millilitre sur ICE en utilisant chaque ensemble d’amorces conformément au protocole écrit. Si la concentration d’ADN est faible, plus d’ADN peut être ajouté à chaque réaction tout en ajustant la quantité d’eau double distillée sans nucléases de sorte que le volume total de la réaction reste de 50 microlitres.

N’utilisez pas plus de cinq microlitres d’ADN ou 10 % du volume total par réaction car les impuretés contenues dans les échantillons d’ADN peuvent inhiber les réactions PCR pour s’assurer que tous les réactifs PCR fonctionnent, bien configurer le contrôle positif. À l’aide des amorces de contrôle positif, configurez le contrôle négatif en utilisant le même ensemble d’amorces de contrôle que le contrôle positif, mais avec de l’eau distillée deux fois au lieu de l’ADN extrait à ce stade, il y a un total de quatre réactions PCR pour chaque échantillon testé. Ensuite, effectuez des amplifications PCR dans un thermocycleur équipé d’un couvercle chauffant en utilisant les paramètres de cyclage PCR dans le protocole écrit, l’optimisation de la température d’agenouillement, des temps d’extension et du nombre de cycles peut être nécessaire en fonction de la qualité des amorces d’ADN, de la polymérase ou du type de thermocycleur utilisé.

Une fois les réactions PCR terminées, séparez les produits PCR sur un gel à 1 % à l’aide d’une électrophorèse standard. Analysez les échantillons à environ 120 volts jusqu’à ce que le front D atteigne les trois quarts de la longueur totale du gel. Visualisez le gel sous la lumière UV et inspectez les bandes résultantes pour voir si un fragment d’ADN approprié a été amplifié.

Ce gel représentatif montre les résultats de l’électrophorèse des produits PCR dérivés d’échantillons d’ADN d’herbe de Kogan, d’herbe de sang japonaise et d’herbe de sang japonaise combinés à de l’herbe de Kogan et des amorces spécifiques de JBG, ainsi que le contrôle positif du tour LF et un contrôle négatif sans modèle. L’ensemble d’amorces de contrôle positif turn LF fonctionne aussi bien pour l’herbe de Cogan, l’herbe de sang japonaise, l’herbe de sang japonaise et d’autres herbes, et donnera une bande de 890 paires de bases. Si tous les réactifs de PCR sont exempts de contaminants d’ADN, la réaction de contrôle négative n’aboutira pas à un produit de PCR.

Si l’échantillon d’ADN est dérivé de l’herbe de kogan de type sauvage, une réaction PCR utilisant l’ensemble d’amorces spécifiques à l’herbe de Kogan entraînera une seule bande à environ 595 paires de bases, tandis que les amorces spécifiques JBG n’aboutiront à aucune bande. De même, si l’échantillon d’ADN est dérivé de JBG ou d’une réaction J-B-G-A-P-C-R inversée, l’utilisation de l’ensemble d’amorces spécifiques à JBG donnera une seule bande à environ 594 paires de bases. Alors que les amorces spécifiques à l’herbe Kogan n’entraîneront pas de bande.

Étant donné que JBG et JBG inversé ont une séquence d’acide nucléique identique, ils auront donc des motifs de bandes identiques. Cependant, les différences morphologiques entre JBG et JBG reverts sont assez évidentes, de sorte que même si les résultats de la PCR sont les mêmes, les variétés JBG sont faciles à distinguer au niveau de la plante. Le séquençage de l’ADN des produits de PCR permet d’identifier d’éventuels changements dans les séquences d’ADN pour différents écotypes d’herbe de cogan.

Le développement de cette technique fournit la première méthode moléculaire simplifiée capable de distinguer avec précision le type K sauvage et l’herbe et la forme inversée de sa variété ornementale, l’herbe de sang japonaise. Nous encourageons les utilisateurs de ce protocole à nous contacter pour nous signaler les résultats dérivés de l’utilisation de ce protocole. Ces informations partagées aideront à fournir des informations sur la distribution de l’herbe de sang japonaise.

Cela aidera également les organismes de réglementation de l’USDA à prendre des décisions éclairées sur les mesures qui pourraient être nécessaires pour contourner la propagation et l’hybridation potentielle des variétés de graminées Cogan très envahissantes.